基于虛擬篩選技術對氟康唑細胞毒性的機制評價

李松哲 孫悅 蔡凌云 孫陽

(黑龍江中醫藥大學基礎醫學院,哈爾濱 150040)

氟康唑作為一種廣譜抗真菌藥物[1],在體外對各種真菌酵母菌有效[2]。基于這一特性,氟康唑被認為可以作為防治細胞污染的手段[3],并有觀點指出在5%～10%用量時不會對細胞造成明顯損害[3-5]。細胞培養過程中的污染現象雖然偶發,但由于感染來源及菌種眾多,一旦出現便較為棘手,影響實驗進展,尤其對于貴重細胞常采取保守的補救措施。但是,隨著研究的進一步深入,有相關文獻認為氟康唑可能對細胞具有遺傳毒性/致突變的作用[6],不僅如此,根據美國食品藥品監督管理局(FDA)的用藥指導,氟康唑具有肝毒性風險,且對于腎功能不全的患者,應當減少氟康唑的使用劑量。這意味著氟康唑可能會導致細胞損傷而影響實驗的客觀性,本文將通過虛擬篩選技術,使用3種細胞株驗證氟康唑對細胞活性的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

人肝癌SMMC-7721細胞購自FuHeng(上海)。人胚肝HHL-5細胞和人胚腎HEK-293細胞購自Otwo Biotech (深圳)。DMEM高糖和1640培養液購自BOSTER。氟康唑氯化鈉注射液購自四川科倫藥業股份有限公司。細胞增殖及毒性檢測試劑盒和Hoechst 33342染色液購自MeilunBio。碘化丙啶(PI)購自Sigma。RNAeasyTMAnimal RNA Isolation Kit with Spin Column和BeyoRTTMIII First Strand cDNA Synthesis Master Mix (5X)購自Beyotime。ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix購自Vazyme。引物合成購自Comate Bioscience Co.,Ltd,引物序列見表1。

1.2 虛擬篩選實驗

潛在靶點的收集 根據FDA對氟康唑的用藥原則,推測可能損傷的靶點范圍,以“hepatotoxicity”“nephrotoxicity”和“cytotoxicity”分別作為關鍵詞,挖掘GeneCards數據庫(https://www.genecards.org)(2022年1月下載)涉及毒性損傷的潛在靶點,所搜集的靶點僅保留相關性得分≥30的信息。

構建與分析“毒性靶點”PPI網絡 為進一步明晰核心毒性靶點,將3次檢索所得的潛在靶點取交集,通過Venn(http://bioinformatics.psb.ugent.be/people)完成hepatotoxicity、nephrotoxicity和cytotoxicity的交集處理,并繪制韋恩圖。再將交集靶點提交至STRING數據庫[7](https://string-db.org)構建蛋白互作(PPI)網絡模型,“Organism”設定為“Homo sapiens”,置信度設為0.4,得到PPI網絡。再將此網絡導入CytoScape3.70中分析,根據各個節點的“Combined degree”值大小,通過對可視化參數的調整篩選核心潛在蛋白質。

氟康唑與核心靶點蛋白的搜集 通過Zinc15數據庫[8]檢索氟康唑分子結構,下載mol2文件。根據PPI網絡明確潛在的核心靶點,通過RCSB PDB數據庫(http://www.rcsb.org/) 下載這些靶基因對應的蛋白晶體結構。

分子對接軟件及前期準備 分子對接軟件采用autodockTools 1.5.6中的vina模塊[9],其中根據vina報道,經vina處理的分子-靶點對接結果中,均方根偏差(root mean square deviation,RMSD)<2的比例高達78%,RMSD<2被認為對接方案可行,故通過vina的分子對接預測可以被認為可行性、準確性較高。根據之前的對接辦法[10],將氟康唑小分子和靶點蛋白通過去除水分子,加氫進行預處理,采用半柔性及盲性對接法實行預測,其余參數均采用默認值,得到預測結果,因本次實驗最終采取qRT-PCR實驗驗證,故忽略其生成氫鍵等可行性前提,結果僅取最小結合能作為參考,且可視化對接結果。

1.3 細胞培養

人肝癌SMMC-7721細胞和人胚腎HEK-293細胞使用含10%胎牛血清與1%青/鏈霉素的DMEM培養液培養,人胚肝HHL-5細胞使用含10%胎牛血清與1%青/鏈霉素的1640培養液培養。3種細胞使用25 cm2培養瓶常規培養,待細胞密度長至80%～90%時進行傳代處理,將細胞制成細胞懸液分瓶傳代,傳代后放入恒定37 ℃、5%的CO2培養箱中繼續培養。實驗取對數生長期細胞。

1.4 細胞毒性實驗

分別將3種細胞等量鋪于96孔板上,每孔體積100 μL,然后放入細胞培養箱內孵育貼壁12 h。貼壁后對細胞進行加藥處理,設置空白組、對照組與給藥組,給藥組加5%與10%的氟康唑,每組設置3個復孔。之后繼續培養24 h,待完成后按每孔10 μL加入CCK-8試劑,暗孵育1～1.5 h,置于酶標儀檢測吸光度,酶標儀參數為37 ℃環境,450 nm波長檢測,得到數據統計OD值,依據公式計算細胞抑制率。抑制率=[(對照孔吸光度-給藥孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%。

1.5 Hoechst 33342/PI雙染實驗

配置Hoechst 33342母液為1 mg/mL,PI母液為2 mg/mL。分別制備3種細胞的細胞懸液,每孔細胞配懸液加至1 mL,放入培養箱培育過夜。次日更換培養液并加入5%與10%的氟康唑持續24 h,待完成后棄上清,使用PBS清洗3次,最后每孔加入1 mL的PBS、5 μL的Hoechst 33342和2.5 μL的PI,放入培養箱繼續孵育20 min,于熒光顯微鏡下觀察,1 h內完成觀察拍照。

1.6 總RNA提取和qRT-PCR檢測

設置對照組與給藥組,給藥組加10%氟康唑。作用24 h后,用離心柱提取對照組和給藥組的總RNA。使用BeyoRTTMⅢ First Strand cDNA Synthesis Master Mix (5X)按照說明將 RNA 逆轉錄為cDNA。采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix配置擴增反應體系,PCR擴增40個循環,95 ℃預變性30 s,95 ℃持續15 s,56 ℃處理15 s并在72 ℃下延伸25 s。以GAPDH為內參基因檢測目標基因相對表達量。每個樣品重復3次,基因的相對表達水平根據2-ΔΔct計算。

1.7 統計學分析

所有統計分析均使用SPSS 26.0軟件進行,通過獨立樣本t檢驗分析組間差異,以P<0.05為差異具有統計學意義,P<0.01為差異具有極顯著統計學意義。

2 結 果

2.1 虛擬篩選實驗

潛在靶點的獲取 根據相關度篩選后,以“hepatotoxicity”關鍵詞共獲靶點633個,以“nephrotoxicity”關鍵詞共獲靶點553個,以“cytotoxicity”關鍵詞共獲靶點8581個。

“毒性靶點”PPI網絡構建 將3個關鍵詞篩選的靶點取交集,并通過Venn網站繪制韋恩圖,見圖1A。得到毒性共同靶點216個。再將相同靶點提交至STRING數據庫分析,輸出數值使用CytoScape 3.70進行可視化分析,見圖1B。網絡毒理學模型共包含節點210個,表示預測的作用靶標,邊線3430條,表示蛋白之間的相互作用關系。節點的顏色越深,圓圈越大,代表連接度的值越大。可視化后發現,白細胞介素(IL)-6、抑癌基因(TP53)、腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素(IL)-1β、血管內皮生長因子A(VEGFA)以及表皮生長因子受體(EGFR)這6個靶標的連接度值最大,表明這6個靶標在本次模型中關聯度最強,所以可認為這6個靶標是氟康唑潛在的毒性核心靶標。

對接靶點的收集與結果 根據“combined degree”收集排名前6的核心靶點,將氟康唑與核心靶點逐一對接,結合自由能單位為kcal·mol-1,靶點PDB編號、分辨率及對接結果見表2。依據所得數據分別可視化核心靶點的最優對接數據,利用VMD軟件可視化對接構象疊合圖,使用蛋白質配體相互作用圖譜(protein-ligand interaction profiler, PLIP)對對接結果進行分析[11],核心靶點的對接展示見圖2。

表2 靶蛋白編號及對接結果Tab.2 Target protein numbers and docking results

2.2 細胞毒性實驗結果

在5%和10%的藥物濃度下對3種細胞進行了CCK8檢測,結果見圖3A～C,總體來看,氟康唑對SMMC-7721細胞和HHL-5細胞具有抑制作用,抑制率在10%左右,而對HEK-293細胞則表現出促增殖作用。當藥物濃度在5%時,對SMMC-771細胞和HEK-293細胞的抑制/增殖無統計學意義(P>0.05),對HHL-5細胞具有顯著的統計學意義(P<0.01)。當藥物濃度在10%時,對3種細胞的抑制/增殖皆有極顯著的統計學意義(P<0.01)。

2.3 Hoechst 33342/PI雙染實驗結果

熒光染色結果見圖4。鏡下觀察氟康唑在不同濃度下作用細胞24 h后的形態學變化,其中凋亡細胞呈強藍光,晚期凋亡細胞及壞死細胞呈強紅色和強藍色熒光。由圖可見,SMMC-7721細胞與HHL-5細胞在氟康唑作用下不同程度的表現出凋亡/壞死細胞增加,其中,細胞密度隨濃度的增加呈遞減趨勢,而5%濃度下的凋亡細胞高于10%濃度,可能是由于高濃度下能更快誘導細胞凋亡進而被吞噬導致的。而HEK-293細胞的凋亡/壞死細胞略有增多,但總體無明顯改變。

圖4 熒光染色結果Fig.4 Fluorescence staining results

2.4 qRT-PCR檢測細胞基因mRNA表達

在10%藥物濃度下對3種細胞進行了qRT-PCR檢測,繪制火山圖,見圖3D～F。其中灰色代表表達不顯著。綠色代表log2 fold change差異顯著,log2 fold change為對照組與給藥組mRNA相對表達量的差異比較,負值為藥物起到抑制表達作用,正值為起到促進表達作用。藍色代表P值顯著。紅色代表log2 fold change和P值皆顯著。由圖可知,通過對潛在核心毒性靶點的qRT-PCR驗證,發現10%的氟康唑會導致細胞出現不同程度的mRNA表達改變,這種基因水平上的干預可能對癌細胞更為敏感。在靶點干預上,尤其對IL1-β、IL-6和EGFR有更明顯的調控作用。

3 討 論

虛擬篩選技術是提高藥物命中靶點概率的常用方法,能夠降低實驗成本,更快的篩選藥物作用目標[12]。目前,有證據認為10%的氟康唑能夠用來防治細胞污染,且不會對細胞造成損害,但該結論缺乏分子層面的實驗檢測。根據FDA的報道,氟康唑具有肝毒性[13],藥代動力學也受腎功能不全的顯著影響[14-15],所以,無差別地用來防治細胞污染可能會影響實驗的客觀性。

本次實驗利用虛擬篩選辦法,分別對3種細胞使用了5%和10%濃度的氟康唑,結果發現氟康唑在5%的濃度下就已經對人胚肝HHL-5細胞產生了明顯的抑制作用(P<0.01),在10%濃度下對人肝癌SMMC-7721細胞、人胚肝HHL-5細胞和人胚腎HEK-293細胞的增殖/抑制具有明顯的干預作用(P<0.01),并且會影響mRNA的表達水平。其中氟康唑對SMMC-7721細胞和HHL-5細胞具有抑制作用,抑制率在10%左右,而對HEK-293細胞具有促增殖作用,熒光染色結果也符合細胞活性檢測趨勢。在對mRNA的檢測上,對SMMC-7721細胞的基因調控更加明顯,約占67%;而對HHL-5細胞和HEK-293細胞的基因調控較少,各占33%左右。

結果顯示氟康唑具有普遍調控作用的核心靶點為IL1-β、IL-6和EGFR。IL1-β由各種類型的細胞分泌產生,能夠調節基因表達、細胞因子的產生與免疫反應[16]。IL-6是具有多效性的細胞因子,抗IL-6療法可減少炎癥、肝臟急性期蛋白和貧血,并具有抗血管生成作用[17]。總之IL1-β[18]和IL-6[19]參與多條炎癥和癌癥通路[20]。Poursheikhani等[21]發現EGFR能夠通過MEKK信號轉導途徑驅動上皮性卵巢癌細胞的化學抗性,進而起到逆轉化療耐藥的作用。Moon等[22]發現含有WW結構域的轉錄調節子1與EGFR信號通路的協同激活能夠誘導肝細胞癌和膽管癌。除此之外,EGFR也是非小細胞肺癌[23]、乳腺癌[24]等癌種的經典治療靶點。由此認為,氟康唑并不適合廣泛的應用于治療細胞污染,尤其對于腫瘤細胞而言,可能會影響實驗結果,出現假陽性或假陰性情況,降低實驗可重復性。

所以,當出現細胞污染時,應盡量將污染細胞舍棄處理。若要進行除菌操作,可選用低速離心法或增加三抗處理,若要通過氟康唑進行除菌操作,應摸索適合于實驗細胞的毒性臨界濃度,并比對除菌前后細胞靶點的表達水平,盡量避免影響實驗的可重復性。

4 結 論

10%的氟康唑并不適合作為防治細胞污染的安全劑量,對于某些細胞具有一定的抑制作用,并且能夠調控某些靶點mRNA水平的表達。