高通量測序技術在馬爾尼菲籃狀菌病臨床診斷的應用進展

賈瀚翔 楊英

(軍事醫學研究院輻射醫學研究所,北京 100850)

馬爾尼菲籃狀菌(Talaromycesmarneffei,NCBI:txid37727)屬真菌界(Fungi)子囊菌門(Ascomycota)籃狀菌屬(Talaromyces),是該屬唯一的溫度依賴性雙相菌[1],在25 ℃環境下呈菌絲相(傳播相),在37 ℃則表現為酵母相(致病相)。我國廣西、廣東地區以及東南亞國家為馬爾尼菲籃狀菌病(talaromycosis marneffei,TSM)流行區域[2]。中華竹鼠(Rhizomyssinensis)、銀星竹鼠(Rhizomyspruinosus)、大竹鼠(Rhizomyssumatrensis)及小竹鼠(Cannomysbadius)是已知的T.marneffei中間宿主,其分布地域與TSM流行區域密切相關[3-4]。人感染T.marneffei可發展為TSM,臨床表現包括高熱、體重下降、貧血、淋巴結病變、肝脾腫大、呼吸系統癥狀及皮膚病變等。當患者血液或骨髓中證實存在T.marneffei,或累及多個器官出現全身癥狀時,定義為播散性TSM,多見于有疫區旅居史的免疫功能缺陷人群[5]。HIV陽性患者更容易發展為播散性TSM,住院死亡率更高;HIV陰性且免疫功能低下的患者,住院死亡率與免疫功能正常的患者相似,但需要更長的住院時間以康復[5]。此外,HIV陰性的播散性TSM患者,因全身多發侵襲的趨勢,易被誤診為晚期惡性腫瘤[5]。若患者只有一處受累器官或病變,并無全身癥狀或體征,則定義為局限型TSM,臨床上較為少見[5]。如呼吸道侵入T.marneffei,原發癥狀與肺結核或其他真菌感染高度相似,導致誤診率高。因漏診、誤診或延遲診斷錯過最佳治療時機,導致疾病快速進展是TSM患者高死亡率的主要原因。及時確診T.marneffei感染并進行抗真菌治療是降低TSM患者死亡率的關鍵,現就高通量測序技術診斷TSM最新進展進行綜述。

1 mNGS應用于T. marneffei感染的快速診斷

mNGS病原檢測針對患者標本中的所有核酸序列進行高通量測序,通過生物信息學方法去除人源序列后與病原體數據庫查詢比對,注釋得到檢出的病原體信息[6]。在mNGS診斷真菌感染的靈敏度和特異度方面,二代Illumina測序平臺可達到91%和89%;而三代Nanopore測序平臺可達到91%和100%,并且具有實時檢測的特性[7]。

表1是通過檢索萬方醫學網、PubMed文獻數據庫,并限定出版時間為2020年1月至2022年5月得到的mNGS檢出T.marneffei感染的病例報道[8-28]。26例患者年齡分布為7個月至79周歲,表明mNGS無適用年齡限制。表1中的患者從不同部位采集的樣本均檢出T.marneffei序列,除未提及檢測時間的報道外,有13例mNGS檢出陽性早于病原體培養,此外還有7例患者組織病理活檢或病原體培養結果呈陰性。病原體培養比較容易確診HIV陽性患者感染T.marneffei,但對于HIV陰性患者,mNGS對T.marneffei的敏感性遠高于病原體培養[5],并且mNGS陽性結果可對病原體培養起到一定的提示作用。與此同時,病原體培養周期較長,表1中的患者T.marneffei平均培養周期大于7 d,即使確診也可能因延遲診斷影響患者預后。目前,mNGS已經可以在7 h內報告檢測結果,表1中的患者經mNGS檢測獲得T.marneffei陽性結果后,因及時應用抗真菌藥物進行治療,其中大部分患者獲得了較好的預后。qPCR或血清抗原抗體檢測等方法靈敏度高,但需要對疑似病原進行假設,且只能檢測到預設的病原體,因此適合作為對于mNGS陽性結果的驗證方法。mNGS則無需推測潛在病原,并且可以精確區分物種甚至亞型,尤其適用于新發或罕見病原體的診斷。綜上所述,mNGS應用于T.marneffei的快速診斷具有明顯優勢。

表1 26例經mNGS檢出T. marneffei感染的病例報道Tab.1 26 cases of T. marneffei infection detected by mNGS test

目前尚未檢索到mNGS檢出T.marneffei假陽性的報道。Chen等[24]報道了2例mNGS假陰性結果,在兩例樣本中分別檢出23條、5條T.marneffei序列并判別為背景微生物,后經真菌培養確定兩例均為T.marneffei陽性。T.marneffei的基因組較大、細胞壁破壁困難,導致核酸提取效率低。這兩例可能由于檢出的T.marneffei序列數較少,未達到算法設定的陽性閾值,導致假陰性結果。《高通量宏基因組測序技術檢測病原微生物的臨床應用規范化專家共識》指出,對于臨床關注度高且較難檢測的病原菌,可采用獨立判讀標準,檢出1條特異序列即可判別為陽性[29]。因此,對于mNGS陰性結果應慎重對待,需結合臨床表現及其他實驗結果驗證后做臨床診斷。

2 WES應用于HIV抗體陰性TSM患者的遺傳易感性分析

細胞介導免疫功能受損是人感染T.marneffei的主要因素之一[30]。對于HIV陰性TSM患者,若無器官移植、免疫抑制藥物使用或靶向治療等免疫抑制的情形,則應考慮遺傳易感因素,即原發性免疫缺陷導致患者感染T.marneffei的可能性。目前已發現超過400種與PID相關的致病基因,由于PID臨床表型和遺傳背景呈高度異質性,確診存在很大困難[31]。WES是將全基因組中編碼外顯子區域的DNA捕獲并富集后進行高通量測序的基因組分析方法,目前已應用于PID一線診斷[32]。

表2是通過檢索萬方醫學網、PubMed文獻數據庫,并限定出版時間為2020年1月至2022年5月得到的HIV抗體陰性且易感因素不明的TSM患者通過WES診斷為PID的8例報道,測得突變位點分別位于STAT1、STAT3、NFKB2、RELB、TSC2、CARD9等基因[15,21-22,33-36],其中7例應用家系全外顯子測序(trio-WES),能夠判斷從先證者檢測到的變異是否遺傳自父母,在判斷是否為新發(de novo)突變時尤為重要。據報道,STAT1是免疫缺陷31型的致病基因,發生在STAT1的功能性卷曲結構域(coiled-coiled domain)或DNA結合結構域(DNA binding domain)的突變可導致Th1和Th17型炎癥細胞因子反應降低,可能提高宿主對T.marneffei的易感性[15, 36]。STAT3突變導致的PID遺傳模式復雜,存在外顯不全的可能,STAT3的功能缺失影響淋巴細胞發育和功能,可能導致機會性感染[33]。NFKB2屬于NF-κB/Rel轉錄因子家族,是調節感染免疫反應的關鍵蛋白復合物[15]。RELB參與NF-κB的替代途徑[34]。由TSC2基因失活導致TSC2突變介導的mTOR信號通路異常,可能誘發支氣管肺發育不良,增加患者對肺部微生物感染的易感性[21]。CARD9是真菌免疫監測的關鍵分子,主要在巨噬細胞和髓樣樹突狀細胞中表達,通過接收來自多個C型凝集素樣受體的信號和刺激促炎癥反應,在抗真菌防御中發揮中心作用[22, 35]。綜上所述,對于HIV抗體陰性以T.marneffei感染為首發且未發現其他易感因素的患者,尤其是以播散性TSM為首發的兒童患者,需警惕罹患PID的可能性。

表2 8例HIV抗體陰性TSM患者的WES檢測結果Tab.2 WES test results of 8 HIV-negative TSM patients

3 展 望

mNGS已成為推動精準醫學發展的關鍵驅動力。為進一步提升mNGS的標準化和規范化程度,全流程自動化平臺的建立是mNGS今后的發展方向:自動化核酸提取與建庫將濕實驗工作流程標準化,在避免人為引入微生物污染的同時,可以大幅提高實驗效率;生物信息學分析平臺的云端化,提供了安全穩定的運行環境、實時更新的數據庫以及標準化的分析流程,顯著提升mNGS結果解讀的可靠性與時效性。WES是目前臨床進行基因診斷的重要技術手段,顯著提升了識別臨床變異位點的能力。篩選出更多具有臨床意義或潛在臨床意義的變異位點,需要科研人員與臨床密切合作,完善對基因功能的鑒定與驗證。隨著人類基因突變數據庫的不斷更新,WES的臨床診斷價值必將進一步凸顯。