孢子絲菌病血清學診斷的研究進展

崔巖 石瀅 Mulubwa Changa Chibesa 李珊山

(吉林大學第一醫院,長春 130021)

孢子絲菌病(sporotrichosis)是我國最常見的慢性真菌病,主要侵犯皮膚、皮下組織及附近淋巴管。目前認為,該病由致病性孢子絲菌(pathogenic clade of the genusSporothrix)感染所致,其主要包括申克孢子絲菌(S.schenckii),巴西孢子絲菌(S.brasiliensis)以及我國主要流行株球形孢子絲菌(S.globosa)[1]。

目前孢子絲菌病常用的診斷方法包括真菌培養和皮膚組織病理檢查,這兩種方法不僅所需時間較長。因快速、技術門檻低等優勢,血清學診斷的適用疾病不斷通過研發而拓展,如β-1,3-D-葡聚糖(G試驗)、曲霉半乳甘露聚糖(GM實驗)、隱球菌莢膜多糖(GXM)等檢測,已在臨床中廣泛應用[2]。盡管尚無商品化的孢子絲菌病血清學檢測試劑盒,但是研究人員目前已發現了可適用于該病檢測的抗原靶點,并在臨床試驗中驗證了其有效性。本文將對孢子絲菌抗原及孢子絲菌病血清學診斷的研究進展進行綜述。

1 鼠李甘露聚糖肽

1971年,Lloyd等[3]首次從申克孢子絲菌酵母細胞和其培養基中提取了一種全新結構的肽多糖,即鼠李甘露聚糖肽(peptidorhamnomannan,PRM)。經單糖分析發現,PRM中主要含有D-甘露糖(50%)和L-鼠李糖(33%)以及少量的半乳糖(1%)和多肽(16%),其中鼠李糖和甘露糖結合形成鼠李甘露聚糖復合物的結構是首次發現。瓊脂擴散實驗顯示,PRM(特別是其中的多糖成分)可以與孢子絲菌病患者的血清發生特異性凝集,提示PRM作為血清學檢測抗原靶點的應用前景。隨后10年,研究人員不斷對孢子絲菌細胞壁多糖的結構深入研究。Travassos等[4]分析申克孢子絲菌細胞壁肽聚糖結構發現,N-糖鏈中的主鏈為α-D-Manp-(l→6)- D-Manp,側鏈則有兩種α-L-Rhap-(l→2)- α-L-Rhap-(l→3)-D-Manp- (l →和α-L-Rhap-(l→3)-D-Manp。免疫沉淀結果顯示,這兩種側鏈都具有抗原性。此外,利用β-消除的方法,Lopes-Alves等[5]首次分析了PRM中的O-糖鏈的結構,發現存在以下的寡糖結構:Man(αl→2)Man-ol, Rha(αl→3)Man(αl→2)Man-ol, Rha(αl→4)GlcA(αl→2)Man(αl→2)Man-ol和Rha(αl→4)[Rha(αl→2)] GlcA(αl→2) Man(αl→2)Man-ol。抗原性試驗顯示,O-糖鏈的寡糖對維持PRM的免疫原性具有重要的作用,其中的抗原表位[6]存在于四糖和五糖中。盡管后續又從Pseudallescheriaboydii[7]、Rathayibacterspp.等[8]微生物細胞壁中分離出了鼠李甘露聚糖,但是其中的糖苷鍵結構存在差異,表明PRM作為抗原可具有良好的特異性[9]。

2 Sporothrix schenckii ConA binding fraction (SsCBF)

為了更加特異并簡化提取PRM的步驟,Penha首次利用刀豆蛋白A(ConA)親和層析柱,從申克孢子絲菌酵母細胞中獲得了PRM,并將可與ConA親和層析柱結合的組份定義為SporothrixschenckiiConA binding fraction(SsCBF)[10]。研究者將SsCBF作為ELISA的底物,以檢測孢子絲菌病患者血清中的特異性IgG。在受試的35份孢子絲菌病患者中,血清滴度為1∶400時,陽性率為100%,而對其他真菌感染的患者無交叉性。通過β-消除的方法證明SsCBF的特異性表位存在于四糖和五糖,這與之前報道結果的一致。在隨后的研究中, 研究者利用同樣的方法分別開展了兩項大樣本血清學檢測,其中1項檢測了92例孢子絲菌病患者,其敏感性為90%,特異性為80%;另1項研究檢測了177例孢子絲菌病患者, 其敏感性為89%, 特異性為82%[12]。這兩項研究的樣本均涵蓋了孢子絲菌病的各種臨床型別,而且這種方法也可以適用于腦脊液檢測。隨訪發現,在部分患者中,血清中特異性IgG的滴度會隨著患者疾病的轉歸而降低。在臨床病例中,有學者將這種方法作為孢子絲菌感染的輔助診斷,但僅是個案報導[13-14],其結果與真菌培養一致。

SsCBF的檢測同樣適用于貓孢子絲菌病的診斷,在1份30例貓孢子絲菌病血清檢測的報道顯示,其敏感性為90%,特異性為96%[15]。由于貓孢子絲菌病主要因巴西孢子絲菌感染導致,Baptista等[16]利用SsCBF檢測了15例由巴西孢子絲菌感染的貓孢子絲菌病,結果顯示,15例中只有1例呈現假陰性反應,提示來自申克孢子絲菌的CBF組分也可以對巴西孢子絲菌病感染的患者或動物進行檢測,也表明寡糖表位可能廣泛存在于巴西孢子絲菌、申克孢子絲菌和球形孢子絲菌中。

3 胞外抗原

與CBF的獲得相比,來自菌體分泌胞外抗原(exoantigen)的獲取工藝流程更為簡單:通過對孢子絲菌菌絲相或酵母相的菌液滅活、過濾、凍干后,即可獲得。胞外抗原的靶點主要是其多組分的可溶性蛋白,因蛋白表達受多種因素影響,來自不同課題組的蛋白范圍差異較大,分子量包括110～120 kDa、90 kDa、80～85 kDa、70～76 kDa、60 kDa、40～48 kDa、30～38 kDa(考慮到實驗結果分別來自不同的報道,蛋白分子量的差異可能是由于估算導致的,因而部分蛋白用范圍表示)[17-22]。盡管胞外抗原的蛋白譜變化較大,但特異性蛋白靶點較為集中,如球形孢子絲菌為菌絲相35 kD蛋白、申克孢子絲菌為菌絲相40 kD、70 kD和90 kD蛋白和巴西孢子絲菌的酵母相85 kD蛋白[17-18,20,22-23]。

Scott等[17]以申克孢子絲菌胞外抗原作為靶點,利用ELISA法檢測了孢子絲菌病患者血清中IgG,結果顯示40例孢子絲菌病患者血清滴度為128～65200,健康人和非孢子絲菌真菌病患者血清滴度均不大于64,三組的陽性率分別為100%(40/40),20%(20/100)和18%(54/300)。盡管上述研究中異種真菌病患者血清陽性率較高,但結果提示ELISA作為一種定量檢測手段,可以增加稀釋倍數和提高cutoff值,以提高特異性。利用這種方法,Almeida-Paes等[24]將血清4000倍稀釋,cutoff值設為0.582時,ELISA的敏感性為97%,特異性為89%。另一項研究[25]也顯示了類似的結果,敏感性和特異性分別為100%和98%(血清經500倍稀釋)。

有趣的是,來自申克孢子絲菌的胞外抗原也可用于貓孢子絲菌病的檢測,敏感性和特異性分別為96%和98%,檢測效果優于SsCBF-ELISA[15],這提示巴西孢子絲菌和申克孢子絲菌的胞外抗原抗原表位相同,這可能來自于胞外抗原中糖蛋白的糖苷鍵或同源蛋白。

4 Gp70

在尋找可用于孢子絲菌病血清學診斷分子靶點的過程中,研究者發現無論在酵母相中,胞外[23, 26]、細胞壁[27-28]或總蛋白[29-30]均存在具有抗原性的分子量約為70 kD的糖蛋白(Gp70)[26, 31]。這種糖蛋白存在N-糖鏈和O-糖鏈連接位點[27, 32]。通過免疫印跡2D電泳顯示,申克孢子絲菌的Gp70存在6個亞型,他們的分子量相近,質譜鑒定分析比對結果顯示均為三羧酸環化酶[30, 32-33]。在巴西孢子絲菌和球形孢子絲菌中[33],也存在該蛋白,但是他們的分子量存在差異。巴西孢子絲菌的三羧酸環化酶的分子量為60 kD,球形孢子絲菌的分子量為70kD[29, 32],分子量的差異可能與氨基酸組成、糖基化修飾或是翻譯后加工有關。見圖1。

圖1 孢子絲菌病血清學診斷的抗原靶點示意圖. 孢子絲菌細胞壁主要由黑素(melanin)、鼠李甘露聚糖肽(peptidorhamnomannan,PRM)、β-1,3葡聚糖(β-1,3-glucan)、β-1-4葡聚糖(β-1,4-glucan)、β-1-6葡聚糖(β-1,6-glucan)以及幾丁質(chitin)組成。胞外抗原(exoantigen)是孢子絲菌分泌的可溶性蛋白;Gp70可存在于細胞外、細胞壁或細胞內。PRM是細胞壁最外層的主要抗原表位,右側示意圖展示了孢子絲菌菌絲相(mycelium)和酵母相(yeast)的N-糖苷鍵(A)和O-糖苷鍵(B)的糖苷鍵結構Fig.1 Antigen target diagram for serological diagnosis of sporotrichosis. The cell wall of Sporothrix primarily consisted of melanin, peptidorhamnomannan (PRM), β-1, 3-glucan, β-1,4-glucan, β-1, 6-glucan, and chitin. Exoantigens were soluble proteins secreted by Sporothrix. Gp70 could be found extracellularly, in the cell wall, or intracellularly. PRM represented the major antigenic epitope in the outermost layer of the cell wall. The right-hand diagram illustrated the glycosidic bond structures of N-glycosidic bonds (A) and O-glycosidic bonds (B) in the mycelial and yeast phases of Sporothrix

Gp70可被申克孢子絲菌感染的孢子絲菌病患者、貓或誘導感染的小鼠血清識別,表明Gp70具有跨種屬的免疫原性,可刺激機體產生特異性抗體[22, 28-29]。且申克孢子絲菌的Gp70也可被由球形孢子絲菌和巴西孢子絲菌感染的宿主血清識別[29-30]。但是Gp70卻不能識別環境分支的孢子絲菌,如墨西哥孢子絲菌導致的感染[30]。盡管多份報道顯示Gp70具有良好的免疫原性并且其單克隆抗體的免疫保護作用,目前缺乏利用天然的Gp70作為血清學診斷的評估報道,這與無法獲得足夠的Gp70有關。因此,Martínez-lvarez等[34]通過原核表達載體Escherichiacoli得到了重組的Gp70。重組Gp70的分子量為43 kD,與去糖基化天然Gp70分子量相近。重組Gp70和去糖基化Gp70可以與天然Gp70蛋白的單克隆抗體mAB P6E7結合,表明重組的Gp70不僅保留了抗原表位,而且mAB P6E7的抗原決定簇來自于氨基酸序列。但是重組Gp70-ELISA檢測孢子絲菌病患者血清的敏感性僅為69.7%,遠低于SsCBF或胞外抗原的方法。

5 小 結

近30年來,隨著動物源性傳播鏈的加入使孢子絲菌病發病率逐漸升高,傳播速度不斷加快,并伴有全球爆發流行趨勢,孢子絲菌病已成為人類和動物健康不可忽視的潛在威脅[1]。準確、快速的診斷方法是孢子絲菌病及時治療和遏制傳播的有效手段。已有的研究結果表明了血清學診斷在孢子絲菌病中的可行性,其中SsCBF是目前具有應用前景的靶點。一方面,SsCBF的抗原表位以O-糖鏈為主,其獨特的糖苷鍵是其他病原真菌中未見的,降低了交叉反應;另一方面,Con A親和層析柱為SsCBF的制備提供了穩定、批量生產的條件。目前商品化的真菌血清學檢測試劑盒,其抗原同樣來自于多糖,如β-1,3葡聚糖、半乳甘露聚糖、莢膜多糖等,這也為開發孢子絲菌的血清試劑盒奠定了良好的工藝基礎。

目前研究報道的血清學檢測技術方法主要以ELISA為主,盡管免疫擴散、乳膠凝集法敏感性也較高,但是ELISA可以通過預設cutoff值,實現對檢測值進行定量,參數可變性強,而且可對多種抗體聯合檢測。利用ELISA進行早期檢測,可縮短診斷時間,并可降低真菌培養的假陰性病例。現有研究結果表明,由于不明確抗體特異性位點或抗原表位,與異種真菌感染血清的交叉反應是導致ELISA產生假陽性的最主要原因。Almeida-Paes等[35]以胞外抗原作為靶點,同時檢測了患者血清中IgA、IgM、IgG等抗體,結果顯示當兩者或三者同時陽性時,可有效排除交叉反應導致的假陽性。另外,還可以通過添加特異性緩沖液,降低抗體和抗原的低親和力結合,降低交叉反應[36]。未來,在ELISA檢測體系成熟的基礎上,可以考慮以紙層析開展的檢測,如膠體金或熒光標記,使孢子絲菌病的診斷更為快速和便捷。

孢子絲菌病血清學診斷方法的商品化,仍有諸多工作需要開展,如球形孢子絲菌感染患者大樣本檢測、患者不同群體的有效性、免疫球蛋白單獨或聯合檢測等。綜上,在未來應用中,血清學診斷不僅可以作為真菌培養或病理檢測的輔助診斷,而且血清學診斷還可用于監測病情的發展,甚至是曾感染情況的排查。