外周血宏基因組二代測序診斷侵襲性肺曲霉病的運用

丁志榮 曾海文 林天來 陳偉文

(福建醫科大學附屬泉州第一醫院重癥醫學科,泉州 362000)

從定植到侵襲性感染,曲霉與許多下呼吸道疾病有關。大多數這類疾病要么免疫反應過度(如過敏),要么免疫反應不足[如侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis,IPA)]。IPA是最嚴重的曲霉相關感染類型,預后最差[1-2],死亡率高達50%[3]。已知的IPA危險因素包括以下幾種免疫抑制狀態:長時間中性粒細胞減少癥、T細胞缺陷、血液系統惡性腫瘤伴或不伴干細胞移植、獲得性免疫缺陷綜合征(艾滋病)、慢性肉芽腫病、實體器官移植和長時間大劑量類固醇治療[4-6]等。IPA的發病率正在增加,且在非免疫功能低下患者中也有越來越多的報道,特別是在危重癥患者中[7-8],一項對尸檢結果的研究顯示,盡管診斷技術的改進,75%的侵襲性真菌疾病不能在死前診斷出來[9]。研究顯示接受伏立康唑預防和未接受伏立康唑預防的血液病合并IPA患者90 d死亡率分別為46%和59.3%[10],延遲診斷和治療是IPA高死亡率的重要原因[11]。

本研究通過外周血宏基因組二代測序(mNGS)識別IPA,證明其在IPA臨床診斷中具有重要作用。現報道3例患者的臨床癥狀、診斷、治療及預后。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集福建醫科大學附屬泉州第一醫院重癥醫學科在2020年9月9日至2022年9月15日3例外周血mNGS檢測曲霉陽性的患者,并記錄人口學資料、臨床癥狀、影像學檢查結果、實驗室檢查結果、治療和預后。根據2019年歐洲癌癥研究和治療組織和真菌病研究小組(EORTC/MSG)標準,我們將IPA分為確診、臨床診斷和擬診。同時各病例檢測血和支氣管肺泡灌洗液(BALF)1,3-β- D -葡聚糖(G)試驗、半乳甘露聚糖(GM)試驗,G試驗陽性閾值為70 pg/mL,GM試驗陽性閾值為1.0 μg/L[12]。所有數據在分析前均為匿名數據。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 mNGS[操作步驟[13-14]

①臨床樣本按照嚴格的無菌處理標準采集。使用HostZEROTM Microbial DNA Kit試劑盒提取DNA。②文庫構建和測序:使用KAPA HyperPlus Library Preparation Kit試劑盒,按照操作說明構建文庫;使用Agilent 2100 Bioanalyzar 對文庫插入片段的長度進行質控分析,應用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Thermo Fisher Scientific Inc.)質控文庫濃度;測序進行使用NextSeq CN500平臺。通過分析去除低質量和長度小于35 bp的序列進行生物信息分析;然后對比計算減去人類參考基因組使用Burrows-Wheeler,去除的低復雜度的序列的數據同時對比到病毒、細菌、真菌和寄生蟲4個微生物基因組數據進行分類,生成高質量的測序數據。下載自國家生物技術信息中心數據分類參考(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/)。宏基因組分析解釋的閾值標準:對于不同類型的微生物,閾值設置如下,細菌≥50;真菌/支原體/衣原體:序列數≥3;DNA病毒:序列數≥3;寄生蟲:序列數≥100;結核分枝桿菌復合物(MTC):序列數≥1[15]。

2 結 果

2.1 診斷流程

3例經外周血mNGS檢測為曲霉陽性的患者,其他檢查結果均證實3例患者均有IPA。納入患者的流程圖如圖1所示。

圖1 3例IPA診斷過程Fig.1 The diagnostic process of 3 cases

2.2 病例描述

病例1,男性,41歲,2020年9月9日,因“咳嗽、氣喘伴發熱4 d”急診入院,2020年9月5日開始出現咳嗽,可咳出少許白色稀痰,伴氣喘無法平臥休息,發熱體溫最高達40 ℃,就診當地醫院予頭孢替安、左氧氟沙星抗感染氣喘未見改善,仍反復發熱。否認任何基礎性疾病,否認吸煙史,機會性飲酒,具體飲酒量不祥。實驗室檢查(見表1):白細胞計數14.27×109/ L;紅細胞計數4.84×1012/ L;血紅蛋白162 g/L;血小板132×109/ L;中性粒細胞13.21×109/ L;淋巴細胞4.1×109/ L;降鈣素原0.3 ng/ml;C -反應蛋白60.5 mg/L;2020年9月14日胸部CT:雙肺紋理增多(見圖2A、B)。入院診斷:重癥肺炎,呼吸衰竭。入院后給予無創呼吸機輔助通氣,亞胺培南西司他丁抗感染、甲潑尼龍抗炎等處理。入院23 h后因呼吸衰竭加重轉入重癥醫學科予氣管插管接呼吸機輔助通氣,并加左氧氟沙星抗感染等處理,同時進行了痰培養,BALF培養,外周血mNGS、血G試驗和GM試驗等檢查。呼吸衰竭未見改善,仍反復發熱。2020年9月12日,外周血mNGS檢測提示煙曲霉感染(見表2)。2020年9月13日,痰培養及肺泡灌洗液培養提示煙曲霉;2020年9月14日血清G試驗檢測:316.7 pg/mL,GM試驗:4.375 μg/L;肺泡灌洗液G試驗:272 pg/mL,肺泡灌洗液GM試驗4.43 μg/L。外周血mNGS檢測陽性后予伏立康唑抗真菌治療,4 d后因Ⅱ型呼吸衰竭死亡。

表1 實驗室檢查和治療Tab.1 Laboratory examination and treatment

表2 外周血mNGS結果Tab.2 Results of peripheral blood mNGS

圖2 胸部CT表現:病例1胸部CT(A、B)雙肺紋理增粗,可見樹芽征;病例2胸部CT(C、D)雙肺多發條索狀、斑片狀高密度影,雙肺實質密度減低,可見多發囊泡狀低密度影;病例3胸部CT(E、F)可見多發斑片狀、條索狀高密度影,右側胸腔見少量胸腔積液Fig.2 Findings of chest CT scan: Chest CT (A and B) of case 1 showed bilateral lung texture thickening and tree-in-bud sign. The chest CT of case 2 (C, D) showed multiple cords and patchy high-density shadows in both lungs, and the density of bilateral lung parenchyma was reduced, with multiple vesicular low-density shadows. Chest CT(E, F) of case 3 showed multiple patchy and cord-like high-density shadows, and a small amount of pleural effusion in the right thorax

病例2,男性,78歲,因“咳嗽、咳痰、氣喘40年,加重并發熱12 d”2022年7月24日急診入住重癥醫學科。有反復氣喘發作住院治療病史,并長期不規則布地奈德粉吸入劑(普米克都保)控制癥狀。既往有高血壓病史20余年,未規則監測及控制血壓;吸煙50余年,20支/天。查體:體溫38 ℃,呼吸40次/分,桶狀胸,雙肺呼吸音低,未聞及干濕性啰音。肺部CT提示雙肺炎癥,慢性支氣管炎,肺氣腫(見圖2C、D)。入院診斷:重癥肺炎,Ⅱ呼吸衰竭,慢性阻塞性肺疾病急性加重。入院后予氣管插管接呼吸機輔助通氣,并與頭孢哌酮/舒巴坦聯合伏立康唑抗感染治療及對癥處理,同時送檢痰培養、支氣管肺泡灌洗液培養,支氣管肺泡灌洗液G/GM試驗,外周血G/GM試驗,支氣管肺泡灌洗液和外周mNGS。2022年7月25日外周血mNGS提示煙曲霉及黃曲霉感染(見表2);肺泡灌洗液mNGS提示屎腸球菌、白念珠菌、煙曲霉、黃曲霉、單純皰疹病毒1型;血G試驗:489.1 pg/mL,血GM試驗:3.49 μg/L;肺泡灌洗液G試驗:>600 pg/mL,肺泡灌洗液GM試驗4.21 μg/L(見表1);2022年7月27日痰培養結果為煙曲霉。經治療病情未改善2022年7月29日放棄治療死亡。

病例3,女性,62歲,2021年7月26日診斷為T淋巴母細胞淋巴瘤/白血病(T-LBL/L),給予CHOP方案(環磷酰胺+表柔比星+長春地辛+潑尼松)化療8個療程。2022年8月25日再次入院予原方案化療,化療后出現骨髓抑制(見表1)。2022年9月9日出現發熱,最高體溫40 ℃,血液內科給予哌拉西林/他唑巴坦抗感染治療,未見改善,2022年9月11日出現意識模糊,呼吸困難,血壓下降,行肺部CT提示:雙肺炎癥(見圖2E、F),考慮膿毒癥,呼吸衰竭轉入重癥醫學科。給予萬古霉素聯合亞胺培南西司他丁、氟康唑抗感染,同時送檢痰培養、肺泡灌洗液培養、血G試驗、GM試驗,外周血mNGS等檢查。2022年9月13日外周血mNGS提示銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌、黃曲霉、屎腸球菌(見表2),調整氟康唑為伏立康唑抗真菌。2022年9月12日血G試驗<37.5 pg/mL,血GM試驗1.98 μg/L。2022年9月14日血培養提示銅綠假單胞菌、屎腸球菌,痰培養、支氣管肺泡灌洗液培養結果為黃曲霉。2022年9月15日因膿毒癥休克、呼吸衰竭死亡。

3 討 論

近年來,侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)的發病率迅速增加,據估計,全世界每年的患者人數已從20萬增加到30多萬,年平均發病率為4.1例/10萬人,易發生在免疫抑制患者,其中IPA占90%以上,并且死亡率也非常高[16]。目前臨床上IPA常用的診斷方法包括胸部計算機斷層掃描(CT)、半乳甘露聚糖試驗、直接顯微鏡檢查、真菌培養、血漿、血清、全血或支氣管肺泡灌洗液(BALF)聚合酶鏈式反應(PCR)和組織病理學等。IPA的胸部CT可表現為暈征、空氣新月征、樹芽征等,但在細菌感染、伴有組織性肺炎的閉塞性細支氣管炎、伴有多血管炎的肉芽腫病、原發性或轉移性癌癥和局灶性肺損傷中也能觀察到,圖像往往是非典型的,很難通過影像學與其他感染相區分。1,3-β- D -葡聚糖試驗、GM試驗、直接鏡檢、真菌培養等也有敏感性低、特異性差的缺點[17-18]。盡管組織病理學是金標準,但血液病、重癥患者的身體狀況和凝血功能往往很差,有創獲取組織標本的方法往往難以耐受。BALF基因檢測的敏感性和特異性均高于血液基因檢測和培養[17],患者病情危重時難以接受氣管鏡檢查,使其臨床應用受到很大限制,因此,非常需要一種快速且無創的方法來準確診斷IPA。

宏基因組二代測序(mNGS)是一種無偏倚的方法,理論上可以檢測臨床樣本中的所有病原體,特別適用于罕見、新穎和非典型的復雜傳染病病因,比傳統培養方法靈敏度更高[19]。雖然曲霉很難在外周血中生長,但生長在肺泡中的菌絲可以穿透空氣和血液屏障,侵蝕毛細血管內皮細胞,侵入小動脈和肺實質,在這個過程中,DNA片段可能會進入血液,所以外周血PCR檢測可用于診斷IPA,PCR檢測提高了曲霉早期診斷的可能性,PCR技術檢測曲霉存在方法學標準化困難,對實驗場地的配置、實驗操作規范性、操作人員的要求較高,以及傳統PCR、巢式PCR技術存在容易污染樣本、假陽性率高、不能量化等缺點,未能大規模應用。已證實血漿mNGS可以識別重癥細菌性肺炎患者呼吸道病原體進入血循環中DNA[20],但血漿mNGS能否用于IPA的診斷尚不清楚。本研究3例患者均通過外周血mNGS及時被診斷為曲霉感染,病例2和病例3還發現為混合感染,治療期間血培養未能培養出曲霉,我們的研究表明,外周血mNGS可以同時檢測引起肺部感染的細菌和真菌感染,有助于快速明確病情和調整治療方案。Hong等[21]在2018年首次使用血漿NGS技術,確診的侵襲性真菌感染的病原體,包括曲霉菌屬和非曲霉菌屬,在9例患者中,7例血漿NGS上檢測到活檢中發現的相同真菌。我們的研究也證實了外周血mNGS可以用于IPA的診斷,但外周血mNGS的檢測效率還需要大規模的臨床試驗來證實。本研究3例患者均在發熱后采集外周血標本,病程中未再進行外周血mNGS檢測,因此,曲霉cfDNA何時會存在于外周血中,何時采集外周血、外周血采血消毒標準怎么把握也尚不清楚,運用外周血mNGS診斷IPA仍然是需要進一步探索的課題。

本研究有一定的局限性。首先,這是一項回顧性研究,可能存在一定的偏倚。第二,本研究3例患者因血小板低或身體狀況不佳,不能耐受CT引導下經皮肺穿刺或氣管鏡下氣管穿刺,沒有病理結果,雖然3例病例都有微生物學證據且G試驗、GM試驗陽性,但它們畢竟不是IPA診斷的金標準,所以存在不是曲霉感染的可能性。第三,本研究樣本量非常小,診療過程中也只進行了1次的外周血mNGS,無法確定曲霉cfDNA在外周血中的存在時間。

綜上所述,本研究證實了通過外周血mNGS檢測曲霉cfDNA可用于IPA的診斷,且是一種快速、簡單、無創的診斷方法,但目前mNGS檢測費用昂貴,臨床運用受到一定的限制。