基于高通量測序技術對母親和新生兒真菌群落結構關系的研究

鄭欣 程旭梅 雷勝男 周建業 李志強

(西北民族大學 口腔醫學國家民委重點實驗室 甘肅省口腔疾病研究重點實驗室, 蘭州 730030)

新生兒口腔黏膜或其不成熟的免疫系統發生真菌定植和感染是非常嚴重的問題。據統計,40%～80%的新生兒念珠菌感染與白念珠菌定植有關[1]。新生兒口腔念珠菌定植是發生念珠菌敗血癥的危險因素之一[2]。新生兒出現敗血癥的體征和癥狀時,也應該考慮到馬拉色菌、曲霉和接合菌感染的可能性[3]。鑒于真菌感染可能產生的嚴重后果,防止真菌的早期定植對新生兒群體而言至關重要。

與新生兒細菌微生物組相比,新生兒真菌微生物組的結構及其與母體真菌微生物組的潛在聯系較少受到關注。利用高通量測序技術可以研究母親與新生兒真菌群落結構的相關性。目前已有針對性的研究證明特定真菌的傳播方式是母嬰垂直傳播[4-5]。然而,真菌定植是如何發生的,新生兒出生時母嬰之間是否存在特定方式的真菌傳播,這些仍然是未知的。大量關于新生兒口腔細菌菌群的研究表明,新生兒口腔細菌菌群可以在出生前從母親處獲得[6]。新生兒細菌群落的形成和發展很大程度上取決于母代、出生方式及環境等因素[7-8]。胎盤和羊水是胎兒的棲息地,母體和胎兒不僅通過它們交換營養物質、內分泌信號、細胞因子和生長因子,同時也通過它們傳播微生物[9-10]。胎盤和羊水的菌群組成與口腔相似,母體口腔菌群會影響胎盤和羊水菌群,并參與胎兒初始菌群的建立[11-12]。由于口腔當中同時存在細菌和真菌,因此不排除新生兒口腔真菌來源于母親的可能性。

在本研究中,我們從母體口腔、胎盤、羊水和新生兒口腔中采集樣本,比較了4個位點的真菌群落結構特征。通過高通量測序技術分析母親與新生兒真菌群落的相關性,進一步加深對真菌群落建立的認識。

1 材料與方法

1.1 材料

樣本采集 選取在甘肅省婦幼保健院通過剖宮產分娩的25名健康孕婦為研究對象。所有研究對象年齡均在22～36歲;孕期37周以上;無口腔疾病;無糖尿病或與妊娠相關的全身性疾病;過去6個月未使用過抗生素。本研究獲得西北民族大學醫學倫理委員會的批準,研究對象均簽署了知情同意書。從以下4個位點采集樣本:母體口腔、胎盤、羊水、新生兒口腔。新生兒出生后立即用無菌拭子采集新生兒及其母親的口腔樣本,同時立即采集母親的羊水和胎盤組織樣本,用一次性無菌針收集羊水2 mL,手術剪取胎盤組織標本。所有樣品均在無菌條件下處理后冷凍在-80 ℃。

試劑及儀器設備 E.Z.N.A.?HP真菌基因組DNA提取試劑盒 (美國 Omega公司);AMPure XP磁珠核酸純化試劑盒(美國Beckman 公司);適用于Illumina平臺的文庫定量試劑盒(美國Kapa biosystems公司)。PCR儀美國(Bio-Rad公司);Qubit熒光計(美國Invitrogen公司);Agilent 2100生物分析儀(美國Agilent公司);Illumina Miseq測序儀(Illumina公司)。

1.2 方法

DNA提取和測序 使用E.Z.N.A.?HP真菌基因組DNA提取試劑盒按照說明書步驟提取總DNA。對真菌18S和28S rDNA的ITS2區進行擴增,采用的上游引物為:fITS7(5'-GTGARTCATCGAATCTTTG-3'),下游引物為:ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'),并用特異性條形碼對引物5'端進行標記[13]。反應體系為25 μL:模板DNA 25 ng, PCR預混物(NEB,M0536L) 12.5 μL,上下游引物(1 μmol/L)各 2.5 μL,ddH2O補齊至10 μL 。反應條件為:98 ℃ 30s;98 ℃10 s, 54/52 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,35個循環;72 ℃ 10 min。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,然后用AMPure XP磁珠核酸純化試劑盒進行純化,用AMPure XP磁珠核酸純化試劑盒進行定量分析。分別用Agilent 2100生物分析儀和適用于Illumina平臺的文庫定量試劑盒測定測序文庫的分子量和濃度。樣本送至杭州聯川生物技術股份有限公司,利用 Illumina Miseq平臺進行高通量測序。

數據分析 采用VSEARCH(v2.3.4)軟件在97%相似度水平上對序列進行操作單元(operational taxonomic units,OTUs)聚類。為每個OUT挑選代表性序列,用RDP(Ribosomal Database Project)軟件將分類標準分配給每個代表性序列。利用MAFFT(v7.310)軟件比對OTU代表序列,分析不同OUT的系統發育關系。利用QIIME (version 1.8.0)軟件計算多樣性指數,評估alpha多樣性。利用主坐標分析(PCoA)和聚類分析(QIIME)軟件(version 1.8.0)分析beta多樣性。利用SPSS 22. 0 軟件進行數據統計分析。

2 結 果

2.1 一般資料

本研究共收集通過剖宮產分娩的健康孕婦25名,孕期37周以上,年齡范圍22～36歲,平均年齡為(29.04±2.26)歲。所有研究對象均為蘭州市城市居民,沒有特殊生活習慣。

2.2 測序結果及OTU分布

經過濾得到所有樣本中母體口腔、胎盤、羊水、新生兒口腔4個位點的序列總數分別為375495、417396、431265和474730。在97%的相似性水平上聚類得到460個操作分類單位(OTU),其中有54個OTU是4個組共有的,新生兒口腔特有的OTU有22個,母體口腔特有的OTU有91個,羊水特有的OTU有66個,胎盤特有的OTU有75個(見圖1A)。通過比較四組共有OTU的相對豐度,發現羊水和胎盤之間沒有顯著差異,新生兒口腔和母體口腔之間也沒有顯著差異(見圖1B)。

圖1 4個組真菌OTU韋恩圖(A)和共有OTU的相對豐度(B) 圖2 4個組真菌群落alpha多樣性指數Chao1 (A)和 Shannon (B)Fig.1 OTUs Venn diagram of four groups (A) and the relative aundance of the shared OTUs (B) Fig.2 Alpha-diversity of fungal community in four groups by Chao1 (A) and Shannon (B)

2.3 alpha多樣性分析

alpha多樣性指數可評估單個樣本的真菌多樣性。Chao1指數越大,群落豐富度越高。Shannon指數越大,群落多樣性越高。胎盤群落豐富度最高,新生兒口腔最低(見圖2A)。母體口腔、羊水和胎盤Shannon指數沒有顯著差異(P>0.05),但新生兒口腔與其他各組比較Shannon指數統計學差異顯著(P<0.05) (見圖2B),說明母體口腔、胎盤和羊水中的真菌群落多樣性相似。

2.4 門和屬水平上的真菌分布

將從所有樣本中獲得的序列分別在門水平和屬水平進行分類,并評估它們各自的相對豐度(見圖3)。在3%的差異水平上聚類形成的460個OTU可劃分為6個門,168個屬。4個組在門水平上的相對豐度見圖3A。優勢菌門為子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota),相對豐度分別為36.16%～58.41%和40.55%～61.33%。羊水和胎盤子囊菌門的相對豐度(55%～58%)顯著高于新生兒口腔和母體口腔(36%～40%)(P<0.05),而新生兒口腔與母體口腔差異沒有統計學意義(P>0.05),羊水與胎盤差異也沒有統計學意義(P>0.05)。 另一優勢菌門擔子菌門的相對豐度在新生兒口腔與母體口腔間差異沒有統計學意義(P>0.05),羊水與胎盤差異也沒有統計學意義(P>0.05)。

圖3 門水平(A)和屬水平(B)的真菌群落分布 圖4 PCoA主坐標分析(A),PC1和PC2比較;屬水平的多樣本相似性樹(B)Fig.3 The fungal community composition at phylum level (A) and genus level (B) Fig.4 Principle Co-ordinates analysis (A), the insert boxplots show the comparison of PC1 and PC2 between groups;Multiple groups similarity tree at genera level (B)

4個組在屬水平上的相對豐度如圖3B所示。檢出率> 1% 的優勢屬有10個,4組共有的優勢屬為紅酵母屬(Rhodotorula,12.4%～35.3%)、Davidiella(7.6%～13.5%)、Meyerozyma(5.6%～11.4%)、馬拉色菌屬(Malassezia,5.9%～10.9%)和隱球菌屬(Cryptococcus,4.6%～11.0%),其中Davidiella和馬拉色菌屬的相對豐度相近(P>0.05),Meyerozyma和隱球菌屬的相對豐度在4組間差異沒有統計學意義(P>0.05)。 其他屬在4個組中所占比例較低,相對豐度相近。

2.5 群落相似性分析

利用UniFrac軟件加權距離測量進行主坐標分析(PCoA),比較4個組間真菌群落結構的總體變化(見圖4A)。PC1和PC2對真菌群落結構變異的貢獻率分別為44.5%和30.2%。通過比較PC1和PC2的值,又可將4個組分成兩個組群,一組為新生兒口腔和母體口腔,另一組為羊水和胎盤,表明新生兒口腔和母體口腔真菌群落結構相似,而羊水和胎盤群落結構相似(見圖4A)。

采用多樣本相似性樹對四組真菌群落結構進行聚類分析(見圖4B),在屬水平上新生兒口腔和母體口腔聚為一類, 羊水和胎盤聚為一類,表明新生兒口腔和母體口腔的真菌群落結構相似,而羊水和胎盤的真菌群落結構相似。與羊水和胎盤相比,新生兒口腔和母體口腔中的優勢屬明顯更為普遍。相似性樹分析結果與 PCoA分析結果相似。

3 討 論

為了避免母親陰道分娩時可能發生的陰道感染,本研究的研究對象均為剖宮產孕婦,并在無菌手術室進行無菌手術,以排除接觸感染的可能。新生兒的皮膚、口腔和腸道細菌微生物群落主要按照分娩方式聚集,已有研究證明剖宮產會影響產婦分娩時微生物群的傳播模式[14]。實際上對于真菌群落而言,只有關鍵體位的特異性類群會受到出生模式的影響,而不是整個真菌群落結構受影響,因此出生模式并不影響我們對新生兒口腔真菌群落的研究[8]。

各樣本共有的類群主要負責群落的整體結構。本研究結果顯示4個組的共有OTU有54個,且各組序列以共有OTU為主,占比為71.9%～84.1%,說明4個組的真菌微生物組具有相似性。羊水與新生兒口腔微生物群落豐富度差異不顯著,說明羊水與新生兒口腔微生物組成關系密切。羊水是羊膜腔中的保護性液體,在孕期胎兒的發育和成熟過程中發揮著重要作用。胚胎形成早期,羊水是胎兒細胞外基質的延伸,胎兒和羊水之間通過細胞外區發生雙向自由擴散。妊娠8周時,胎兒尿道形成,腎臟開始產生尿液。妊娠20周時,胎兒就開始吞咽。胎兒皮膚在妊娠19～ 25周逐漸角質化,此時胎兒尿液、呼吸道、胃腸道、臍帶和胎盤表面的分泌物成為羊水的主要來源[15]。隨著胎盤和胎兒血管的形成,母體血漿中的水和溶質彌散到羊水中[16]。因此,羊水中的真菌可能被胎兒吞下,并在出生前植入胎兒口中。本研究中母體口腔、羊水和胎盤中真菌群落多樣性相似,說明母體口腔、羊水和胎盤中存在相似的真菌群落,這進一步證明母體口腔中的真菌可能向羊水和胎盤傳播。新生兒口腔真菌群落豐富度和多樣性最低,提示新生兒口腔真菌群落不成熟。由于新生兒體內定植的真菌較少,新生兒出生后的第1個月體內真菌多樣性并沒有增加,并且身體任何部位的真菌群落都沒有明顯成熟[8]。本研究中相似性樹的分析結果表明,母親和新生兒口腔真菌群落結構相似,說明母親和新生兒口腔真菌菌群關系密切。盡管胎兒獲得微生物的時間和特點目前仍不清楚,但我們的結果表明,新生兒口腔真菌定植發生在出生之前。 我們甚至可以推測,母體口腔微生物可以通過血液進入胎盤和羊水,間接影響胎兒口腔微生物的早期形成。

本研究在4個組中檢測出2個共有優勢菌門:子囊菌門和擔子菌門,5個共有優勢屬:紅酵母屬、Davidiella、Meyerozyma、馬拉色菌屬和隱球菌屬,與其他的研究結果相似[17-18]。表明大部分母體口腔真菌也存在于在新生兒口腔、胎盤和羊水中。這些優勢菌可能借助血液或免疫細胞到達母胎界面,然后穿過胎盤到達羊水,最終在新生兒口腔中定植。環境和皮膚等其他來源也可能有助于生命早期真菌群落的形成。本研究中新生兒雖未經陰道分娩,但由于子宮與陰道相連,母親陰道中的微生物群也可能逆行進入胎盤和羊水,并被胎兒口腔環境選擇性的定植與母體口腔相似的真菌群落。

本研究利用高通量測序技術分析母親與新生兒真菌群落結構的相關性,推測新生兒口腔真菌可能起源于母體口腔,為進一步研究母嬰口腔真菌群落相關性和新生兒口腔初始真菌來源提供了一定的理論依據,為母嬰口腔真菌傳播通路研究奠定了理論基礎。由于樣本量偏少且為單中心,今后需要進行更大規模的研究以驗證我們的結果。此外,未來還可對真菌和細菌微生物群落的協同發育進行縱向研究。雖然本研究發現母體口腔真菌可能通過胎盤和羊水傳播到新生兒口腔,但母嬰之間真菌傳播的具體途徑以及傳播的真菌對新生兒健康的影響尚未可知,仍有待進一步研究。