大鼠腦隱球菌感染模型建立及MRI評估

李錦 努爾比耶姆·阿布力克木 王剛 李嫣然 劉露露 姜春暉 王曉東 姜濤 和清源 王云玲 王儉

(1.新疆醫科大學第一附屬醫院影像科,烏魯木齊 830011;2.北京大學第三醫院放射科 磁共振設備與技術北京市重點實驗室,北京 100191)

隱球菌屬中的新生隱球菌和哥特隱球菌是主要致病菌,具有嗜中樞性,每年導致全球100萬例患者感染和60萬例免疫抑制患者(艾滋病、移植受者)因機會性侵襲性感染而死亡[1]。 腦隱球菌感染一般表現為腦膜腦炎,14%～25%的患者可發生腦實質隱球菌肉芽腫[2-3],其隱匿的臨床表現和緩慢發作的癥狀[4],易造成漏診誤診。目前動物模型可復制臨床上不常見的疾病,避免人體實驗造成的傷害,同時獲得人類臨床研究難以獲取的資料。MRI可以提供動物模型與人類疾病相似圖像結果。因此建立有效的腦隱球菌感染模型,探討MRI影像學表現,可為腦隱球菌研究提供與人體接近的實驗模型及評估方法。

1 材料與方法

1.1 研究對象

新疆醫科大學動物實驗中心提供清潔級SD(Sprgue-Dawley)大鼠30只,對大鼠進行編號及體質量測量,均為雌性,4～5月齡,體重250 g左右,于自由進食水的鼠籠內喂養。

新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會論證、批準實施(審批號:20190225-100)。

1.2 隱球菌菌株培養稀釋與制備

新疆醫科大學第一附屬醫院皮膚科復蘇傳代成功的A型新生隱菌轉種于YPD(yeast extract peptone dextrose medium)培養基中,將傳代成功的菌苔稀釋于10 mL生理鹽水,使用微量移液器取1 μL混懸液置于細胞計數板表面,按技術規程進行計數,至少計數兩次,取其平均值,配置成濃度為1×106CFU/mL混懸液備用。

1.3 動物模型建立

大鼠麻醉(肌注舒泰10 mg/kg +鹽酸賽拉嗪10 mg/kg)成功后,立體定位儀固定鼠腦,按《大鼠腦立體定位圖譜》[5]定位標記尾狀核(前囟:前1 mm,右/左3.5 mm)作為針刺點。術區備皮,剃去頭頂毛發暴露囟門,1%濃度碘伏消毒,切開并分離皮下組織及骨外膜;顱骨鉆顱骨鉆孔,骨穿刺針垂直穿刺,有落空感時拔出針芯;10 μL微量進樣器吸取10 μL稀釋備用的菌懸液,緩慢垂直進針約4 mm,以1 μL/min勻速注射入尾狀核,注射完畢后停針8 min,緩慢旋轉拔針2 min,拔針紗布按壓,顱骨鉆孔處骨蠟封閉,外科線縫合,留觀至麻醉蘇醒。

1.4 MRI檢測與MRI圖像判讀

大鼠分別于造模后14 d、21 d、28 d行MRI掃描監測接種情況。大鼠麻醉平穩后,使用德國西門子Skyra 3.0TMRI成像設備、8通道相控矩陣腕關節線圈進行頭顱掃描,大鼠取俯臥位置頭于線圈中心固定,保持呼吸道通暢,掃描序列包括T1WI、T2WI序列。

掃描參數如下:T1WI(T1加權像):TE(回波時間)=3.7 ms,TR(重復時間)=1500 ms,FA(翻轉角)=9°,TI(翻轉時間)=900 ms,層厚=1 mm,FOV(掃描野)=267 mm,體素=0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm;T2WI(T2加權像):TE=92 ms,TR=3620 ms,FA=120°,層厚=2 mm,FOV=80 mm,分辨率=256×256。采集圖像后,由兩名影像科醫生進行分析、判讀,討論影像學表現,確定模型結果。

1.5 病理標本采集與研究

MRI掃描圖像采集完以頸椎脫位法處死大鼠,將所有死亡的大鼠腦與顱骨分離,觀察大腦形態, 切開測量腫瘤大小, 行病理切片制作與HE染色,將制好的病理切片置于電子顯微鏡下,由兩名動物實驗中心病理醫生閱讀切片,分析、確定結論。

2 結 果

2.1 MRI表現

隱球菌肉芽腫形成MRI表現:尾狀核可見類圓形或結節樣異常信號影,T1WI低信號、T2WI高信號。隱球菌性腦膜腦炎MRI表現:尾狀核腦膜、室管膜明顯線樣異常信號改變,伴側腦室不同程度水腫。無異常組:腦實質及腦膜未見明顯異常信號。

2.2 建模成功率與動物生存

第14天建模成功率43.33%:30只SD大鼠腦感染隱球菌模型中1只于造模后第2天死亡;9只(30%)形成隱球菌肉芽腫;4只(13.33%)隱球菌性腦膜腦炎;16只(53.33%)未見明顯異常;其中1只大鼠于14 d常規MRI掃描后死亡,MRI未見明顯異常。

第21天建模成功率60%:28只腦隱球菌感染模型鼠中14只(46.67%)表現為隱球菌肉芽腫形成,7只與第14天MRI表現無差別,3只由腦膜腦炎演變,4只由無異常演變;4只(13.33%)隱球菌性腦膜腦炎,1只與14 d MRI表現無差別,3只由無異常演變;10只(33.33%)未見明顯異常。2只由肉芽腫演變。

第28天建模成功率73.33%:28只腦隱球菌感染模型鼠中18只(60%)表現為隱球菌肉芽腫形成,14只與21 d MRI表現無差別,4只由無異常演變;4只(13.33%)隱球菌性腦膜腦炎;6只(20%)未見明顯異常。

2.3 病理結果(HE染色)

隱球菌肉芽腫病灶肉眼觀鼠腦尾狀核區、部分腦表面可見黃色濃稠滲出液和壞死灶,鏡下觀可見由淋巴細胞及多核巨細胞構成的肉芽腫灶,內見大量類圓形藍染真菌孢子聚集(見圖1)。

圖1 SD大鼠腦感染隱球菌肉芽腫鏡下病理圖像,HE染色10×10倍鏡下(A)見腦實質多發囊腔,腦實質炎性細胞浸潤;HE染色40×10倍鏡下(B)見腦實質散在大量類圓形藍染真菌孢子Fig.1 Microscopic pathological observations of cryptococcal granu-loma of the brain, under 10×10 fold microscope (A) with HE staining, multiple cysts and inflammatory cell infil-tration in brain parenchyma were seen; under the 40×10 fold microscope (B) with HE staining, a large number of round-like blue-stained fungal spores were scattered in the brain parenchyma

腦膜腦炎病灶肉眼觀鼠腦尾狀核區局部充血水腫,鏡下觀可見腦膜和/或腦室管膜多發類圓形藍染真菌孢子。

無異常組肉眼觀鼠腦組織大體未見明顯異常,鏡下觀未見真菌孢子浸潤。

3 討 論

隱球菌是一種具有多糖的孢子囊的酵母菌,是影響神經系統的最普遍的真菌[6],可以感染免疫低下和免疫正常的個體,在免疫功能低下的患者中更常見,如細胞介導免疫功能受損的患者、血液系統惡性腫瘤患者、實體器官移植受者以及接受長期皮質類固醇或其他免疫抑制治療的患者[7]。腦隱球菌感染臨床表現無特異性,隱球菌性腦膜腦炎患者通常在2～4周內出現頭痛、嗜睡、發燒等亞急性癥狀, 僅1/4的患者出現典型的頸部僵硬等腦膜腦炎癥狀[8],免疫功能低下患者隱球菌感染易與其他疾病重疊,導致延遲診斷增加神經系統后遺癥的風險[9],致使隱球菌引起的腦損傷難以正確診斷和有效治療,因此快速鑒別診斷和早期治療對于獲得良好結果至關重要[10]。

建立動物模型是研究隱球菌的方法之一,根據研究需求,選擇合適的動物模型及建模方式是研究的關鍵。研究表明小鼠對隱球菌天然易感,但小鼠體型小,血、腦脊液含量少,無法進行一些精細操作;家兔隱球菌性腦膜腦炎模型則需使用免疫抑制劑[11]。大鼠與人類的生理具有很高的相似性,容易外科操作處理,表現出較少的應激反應。此次實驗大鼠建模后存活率93.33%,死亡率僅6.67%,提示存活率高、可行性強,大鼠可以作為腦隱球菌感染的建模對象。接種方式的選擇,既往研究隱球菌大鼠模型氣管接種主要用于建立隱球菌肺炎模型[12],很難建立顱內感染模型;靜脈注射和腹腔注射可以感染腦或肺,但感染的程度可能不同,無法控制實驗變量的統一[11],所以選擇直接顱內注射,不僅感染方式直接,減少干擾因素,而且此方式易致病并易動態觀察感染狀態。研究結果顯示大鼠隱球菌感染模型成功率為73.33%,形成腦隱球菌肉芽腫60%,形成腦膜炎13.33%,表明直接顱內注射可得到較高的致病率和較高的致病性,可以建立較好的隱球菌感染動物實驗模型。

MRI是一種多功能且無創的成像方式,具有出色的穿透深度、組織覆蓋率和軟組織對比度[13],且人們越來越重視對使用大鼠模型在腦部疾病與藥物干預的縱向研究中MRI的應用[14]。相關研究報道,在隱球菌性腦膜腦炎發生前2個月時, CT常規掃描可無異常發現,但MRI優于CT,可為臨床的早期診斷和處理提供依據[15]。此次實驗以第28天MRI影像表現為最后結果,4只(13.33%)大鼠形成隱球菌腦膜腦炎,隱球菌穿透腦膜血管壁,遷移到 Virchow-Robin(血管周圍)[16]間隙,隨后隨著炎癥細胞的激活和黏液物質的沉積而擴張形成膠狀假囊[17]在MRI表現為尾狀核腦膜、室管膜線樣異常信號改變,伴側腦室不同程度水腫。18只(60%)大鼠形成腦隱球菌肉芽腫形成,大量生物體和凝膠狀物質[18]增殖形成肉芽腫[19]。凝膠狀物質在T1WI顯示低信號,T2WI 成像顯示圍繞高信號中心的低信號環。此次實驗大鼠腦隱球菌肉芽腫在MRI上表現為尾狀核類圓形或結節樣異常信號影,T1WI低信號T2WI高信號。本實驗利用MRI對大鼠隱球菌的建模進行評估,探討每一只大鼠在造模初期、中期、晚期影像學表現,與病理結果比較,結果高度一致,核磁判斷感染準確率高,表明MRI是評估隱球菌感染的有效方法。

本實驗的不足之處在于僅掃描了MRI常規序列,對隱球菌性腦膜腦炎感染的影像學表現探討欠佳;但是成功建立了大鼠顱內隱球菌感染模型,并且能夠確保建模后大鼠的存活率及建模成功率,MRI可以清楚的顯示大鼠腦內病變,一定程度上反映病理學特征。綜上所述,大鼠顱內隱球菌感染模型可為未來中樞神經隱球菌感染研究提供與人體接近的實驗模型,MRI在評估腦隱球菌感染方面有良好的價值。

致謝:感謝海軍軍醫大學第二附屬醫院(上海長征醫院)皮膚科,上海市醫學真菌分子生物學重點實驗室陳敏老師對新生隱球菌培養及傳代技術的支持。