不同濃度伏立康唑對人急性單核細胞白血病細胞株來源巨噬細胞免疫功能的影響

滕國杰 聶秀紅

(首都醫科大學宣武醫院呼吸與危重癥醫學科,北京 100053)

既往研究表明,多種抗真菌藥物除了對真菌的殺滅作用外,還具有免疫調節作用,其可能通過宿主免疫細胞信號通路,調節炎癥反應,影響免疫細胞對真菌的作用。兩性霉素B可以促進炎性細胞因子釋放[1],而氟康唑可以減少曲霉菌絲刺激后人全血IL-6、IL-8和TNF-α的釋放[2]。伏立康唑作為三唑類抗真菌藥物,也具有免疫調節作用。Simitsopoulou等[3]的研究顯示伏立康唑通過TLR2的上調來增強吞噬細胞的促炎程序,Fidan等[4]發現,伏立康唑作用下,白念珠菌刺激的外周血單個核細胞的IL-2、γ干擾素(interferon γ, IFN-γ)和IL-6水平顯著增加。在伏立康唑作用下,煙曲霉誘導THP-1細胞更加顯著的炎癥基因表達,包括干擾素-γ和TNF-α等基因的表達明顯增強,釋放TNF-α、IL-1β明顯增加[5]。

伏立康唑濃度差異是否會對免疫狀況存在不同影響,目前國內外文獻鮮有報道。為此,本研究觀察THP-1來源巨噬細胞加入不同濃度伏立康唑及滅活煙曲霉菌液,檢測細胞培養上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10分泌水平及細胞膜表面模式識別受體TLR2、TLR4、Dectin-1表達的變化,探討伏立康唑藥物濃度對巨噬細胞免疫功能的影響差異。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞及試劑 人急性單核細胞白血病細胞株(human acute monocytic leukemia cell line, THP-1細胞株)來源于中科院細胞庫,RPMI1640培養基(美國Gibco-Invitrogen 公司),胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(美國Gibco-Invitrogen 公司),青霉素-鏈霉素-二抗溶液(美國Gibco-Invitrogen 公司),肉豆蔻酸佛波醇乙酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA)(中國碧云天試劑公司),伏立康唑(美國輝瑞公司生產),二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)(美國Sigma公司)。

煙曲霉菌液的制備 煙曲霉感染患者的分離株,接種在沙堡弱葡萄糖瓊脂培養基上于37 ℃和5% CO2培養箱下培養5 d,以形成分生孢子。分生孢子通過70 nm細胞篩進行過濾,使用RPMI 1640重懸分生孢子,在37 ℃和5%CO2的完全培養基中進行孵育,12 h部分分生孢子形成菌絲,進行收集,將孵育后的煙曲霉分生孢子和菌絲形成的菌液在玻璃管中于120 ℃高壓滅活30 min[6-7]。

伏立康唑藥液配置 伏立康唑粉劑微量電子天平稱取10 mg,無菌操作下溶解于二甲基亞砜,國外文獻報道二甲基亞砜對細胞無明顯毒性作用[8],加入無內毒素蒸餾水補足至1 mL,進行分裝,使用時加入完全培養基,倍比稀釋至所需濃度。

1.2 方法

THP-1來源的細胞誘導為巨噬細胞 文獻報道,THP-1細胞使用100 ng/mL佛波酯(PMA)誘導48 h分化為巨噬細胞[9],具有與人外周血單核細胞來源巨噬細胞類似的功能[10]。受不同微環境的影響,使用PMA誘導THP-1細胞為巨噬細胞,該細胞可以向M1表型進一步分化,也可以向M2表型進一步分化[11]。用100 ng/mL PMA在37 ℃誘導THP-1細胞48 h,倒置顯微鏡動態觀察細胞變化。培養48 h后顯微鏡下觀察細胞形態改變,細胞由懸浮細胞改為貼壁、并出現聚集、偽足伸出。誘導THP-1細胞形成巨噬細胞。將細胞加入0.02%乙二胺四乙酸溶液,使細胞脫離貼壁,離心收集。

CCK-8法檢測不同濃度伏立康唑聯合滅活的煙曲霉菌液對THP-1來源巨噬細胞的毒性 THP-1細胞誘導形成的巨噬細胞,以每孔100 μL培養液中包含5×103個細胞的濃度,接種于96孔培養板。每個孔加入濃度分別為0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL的伏立康唑后,再加入濃度為5×102個/mL的滅活煙曲霉液,并且設置僅含有THP-1來源巨噬細胞和滅活煙曲霉菌液的對照孔。分別37 ℃、5%CO2培養箱中孵育6、12、24 h。之后每孔加入10 μL的CCK-8溶液培養2 h后,用酶標儀在450 nm處測量吸光度值。實驗重復3次,取平均值。

不同濃度伏立康唑聯合滅活煙曲霉菌液體外刺激THP-1來源巨噬細胞 每孔1 mL培養基中包含1×106個THP-1細胞形成的巨噬細胞,接種于2個6孔培養板。孵育過夜。在培養板中,第1孔作為空白孔,其余各孔中加入終濃度為105個/mL的滅活煙曲霉菌液之后,再加入濃度分別為0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL的伏立康唑。并且設置僅含有THP-1來源巨噬細胞和滅活煙曲霉菌液的對照孔,在37 ℃和5%CO2培養箱孵育6 h[12]。培養后,收集培養板中每孔的上清液測定培養上清液中的細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10的水平。收獲貼壁的巨噬細胞,流式細胞儀檢測細胞表面的TLR2、TLR4、Dectin-1表達。實驗重復3次,取平均值。

流式細胞檢測體外培養細胞表面TLR2、TLR4、Dectin-1表達 流式管中加入熒光標記抗體:BD Pharmingen[TM]PE Mouse Anti-Human CD369 (Clec7A)(Dectin-1),BD Horizon[TM]BB515 Mouse Anti-Human CD282(TLR2),BD OptiBuild[TM]BV421 Mouse Anti-Human CD284(TLR4),各5 μg,加入待檢測的細胞,同型對照管加入同型抗體:BD Pharmingen[TM]PE Mouse IgG2a κ Isotype Control,BD Horizon[TM]BB515 Mouse IgG1 κ Isotype Control, BD Horizon[TM]BV421 Mouse IgG2a κ Isotype Control,各5 μg,震蕩混勻,應用BD FACS Canto型流式細胞儀進行細胞表面TLR2、TLR4、Dectin-1的表達檢測。通過Flowjo軟件進行分析,計算表達的平均熒光強度。

1.3 統計學處理

采用SPSS 20.0軟件(IBM, Armonk, NY, USA)進行統計分析,正態分布的計量資料以均數±標準差表示,組間的比較采用Dunnett-t檢驗。非正態分布的計量資料以中位數及四分位數表示,組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。統計學假設檢驗采用雙側檢驗,P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 THP-1誘導形成巨噬細胞

THP-1細胞呈類圓形,在完全培養基中懸浮生長。加入100 ng/mL的PMA后24 h后完全貼壁生長,細胞形態開始出現改變;48 h后,細胞呈現巨噬細胞特征、表現,形態不規則,胞體增大、胞漿疏松出現空泡、細胞表面伸出偽足,包膜周圍可見突起,形成THP-1來源巨噬細胞,見圖1。

圖1 加入100 ng/mL的PMA刺激48 h THP-1細胞分化為巨噬細胞(×40) 圖2 不同濃度伏立康唑聯合滅活煙曲霉菌液對THP-1來源巨噬細胞的毒性:作用12 h:* P<0.05,作用24 h:# P<0.01(與未加入伏立康唑的對照組相比) 圖3 不同濃度伏立康唑聯合滅活煙曲霉菌液刺激THP-1來源巨噬細胞,培養上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10濃度。* P<0.05,# P<0.01(與IAFL組相比) 圖4 流式細胞儀檢測THP-1來源巨噬細胞膜表面受體表達Fig.1 THP-1 cells were stimulated with 100 ng/mL PMA for 48 h and differentiated into macrophages (×40) Fig.2 Toxicity of voriconazole combined with IAFL to THP-1-derived macrophages: 12 h: * P<0.05, 24 h: # P<0.01 (compared with the control group without voriconazole) Fig.3 Levels of TNF-α, IL-1β and IL-10 in culture supernatant of different concentrations of voriconazole combined with IAFL stimulated THP-1-derived macrophages, * P<0.05, # P<0.01 (compared with IAFL group) Fig.4 The expression of THP-1-derived macrophage membrane surface receptor was detected by flow cytometry

2.2 不同濃度伏立康唑聯合滅活煙曲霉菌液對THP-1來源巨噬細胞的毒性

THP-1來源巨噬細胞中加入不同濃度伏立康唑聯合滅活煙曲霉菌液,分別作用6、12、24 h,使用CCK-8法計算細胞相對活力,繪制成活力曲線,見圖2。

結果顯示,與對照組相比,作用于6 h,在伏立康唑濃度為64 μg/mL時,對細胞抑制作用為4.30%±6.1%(P>0.05),作用12 h,伏立康唑濃度64 μg/mL時,顯示19.9%±1.6%的抑制作用(P<0.05);作用24 h后,伏立康唑濃度8 μg/mL及64 μg/mL時,顯示23.1%±7.0%和28.7%±8.1%的抑制作用(P均<0.01)。結果表明,隨時間延長和伏立康唑濃度升高,伏立康唑對THP-1來源巨噬細胞毒性作用顯示出隨時間和劑量依賴的增強。

2.3 不同濃度伏立康唑聯合滅活煙曲霉菌液體外刺激THP-1來源巨噬細胞培養上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10濃度變化

文獻報道,人巨噬細胞細胞在受到外界刺激后,TNF-α等炎癥因子釋放在6 h內達到峰值[12],本研究最終選擇6 h作為細胞功能研究的時間。

在對照組中(LAFL組:僅含THP-1來源巨噬細胞和滅活煙曲霉菌液),培養上清液中TNF-α、IL-1β濃度分別(471.94±56.51) pg/mL和(110.56±15.04) pg/mL,加入不同濃度伏立康唑后,上清液中TNF-α、IL-1β濃度逐漸升高,在伏立康唑濃度4～64 μg/mL之間時, TNF-α、IL-1β濃度較對照組出現顯著升高(P均<0.05)。在伏立康唑的濃度為16 μg/mL和8 μg/mL時,TNF-α和IL-1β濃度分別達到峰值,為(728.32±113.58) pg/mL和(210.08±41.39) pg/mL。不同伏立康唑濃度組之間IL-10濃度差異均無統計學意義(P>0.05),見圖3。

2.4 不同濃度伏立康唑聯合滅活煙曲霉菌液體外刺激THP-1來源巨噬細胞膜表面TLR2、TLR4、Dectin-1表達

在對照組中(LAFL組:僅含THP-1來源巨噬細胞和滅活煙曲霉菌液),流式細胞儀檢測巨噬細胞膜表面模式識別受體TLR2、TLR4的平均熒光強度位于較低水平。加入不同濃度伏立康唑后,細胞膜表面TLR2、TLR4的平均熒光強度逐漸增強,在伏立康唑濃度為1～64 μg/mL時,TLR2、TLR4的平均熒光強度與對照組相比顯著增強(P<0.05),在伏立康唑濃度為4 μg/mL時,細胞膜表面TLR2、TLR4的平均熒光強度達到峰值。模式識別受體Dectin-1對伏立康唑濃度變化更為敏感。伏立康唑濃度在0.5～64 μg/mL時,Dectin-1的平均熒光強度與對照組相比出現顯著升高(P<0.01),在伏立康唑濃度為1 μg/mL時,Dectin-1的平均熒光強度即達到峰值,見圖4、5。

圖5 不同濃度伏立康唑聯合滅活煙曲霉菌液刺激THP-1來源巨噬細胞膜表面TLR2、TLR4、Dectin-1平均熒光強度。* P<0.05,# P<0.01(與IALF組相比)Fig.5 MFI of TLR2, TLR4 and Dectin-1 on the membrane surface of THP-1-derived macrophages stimulated by different concentrations of voriconazole combined with IAFL. * P <0.05, # P <0.01 (compared with IAFL group)

3 討 論

對于曲霉感染患者而言,指南推薦長期口服抗真菌藥物治療,以防止曲霉感染的復發。侵襲性肺曲霉病指南推薦持續治療6～12周[13],慢性肺曲霉病指南推薦至少口服治療6個月,對于存在持續性免疫抑制的患者,則可能需要終身治療[14]。在如此長時間里,藥物對機體免疫功能的影響尤為明顯。

不同組織中伏立康唑的濃度不同,伏立康唑在肺泡上皮襯液中的濃度最高,約為血漿濃度的11倍[15];腦組織中的濃度為血漿濃度的2～3倍[16];房水中的濃度僅僅為血漿濃度的0.53倍[17]。指南推薦伏立康唑血藥濃度應維持在0.5～6 μg/mL,故而推測在肺泡上皮襯液中的濃度約5.5～66 μg/mL,房水中的濃度為0.25～3 μg/mL。在不同組織中,伏立康唑的濃度范圍是0.25～66 μg/mL。本研究觀察了濃度為0.25～64 μg/mL時伏立康唑對THP-1來源巨噬細胞免疫功能的影響。

TNF-α、IL-1β均為促炎因子,在抗曲霉感染中起重要作用[18]。本研究結果顯示,加入滅活煙曲霉菌液后,THP-1來源巨噬細胞分泌TNF-α、IL-1β濃度顯著升高,在滅活煙曲霉菌液存在情況下,伏立康唑的濃度為4～64 μg/mL時,刺激THP-1來源巨噬細胞分泌TNF-α、IL-1β較對照組顯著升高(P<0.05),提示伏立康唑誘導THP-1來源的巨噬細胞促炎因子的分泌,但這種分泌的增加并不隨伏立康唑濃度的倍增而持續遞增,在伏立康唑濃度為8 μg/mL或16 μg/mL時達到峰值。

IL-10是一種有效的抗炎和免疫抑制細胞因子,能降低單核細胞和巨噬細胞活性,抑制單核細胞對曲霉菌絲的氧化爆發和抗真菌活性[19]。有研究報道,在伏立康唑作用下,暴露于曲霉的THP-1細胞IL-10的基因表達無變化[5]。本研究結果同樣表明,不同濃度伏立康唑聯合滅活煙曲霉菌液,對THP-1來源巨噬細胞培養上清液中IL-10濃度無顯著影響(P>0.05)。

參與曲霉識別的模式識別受體主要是TLR2、TLR4和Dectin-1,其中細胞膜表面Dectin-1可以特異性識別真菌細胞壁中的β-葡聚糖[20-24]。有研究表明,伏立康唑通過上調固有免疫系統中模式識別受體TLR2 mRNA表達,增強吞噬細胞促炎程序,促進炎癥因子TNF-α的分泌[3]。本研究結果表明,在滅活煙曲霉菌液存在情況下,濃度為1～64 μg/mL伏立康唑可以刺激THP-1來源巨噬細胞膜表面TLR2、TLR4和Dectin-1表達。推測伏立康唑可以通過刺激巨噬細胞膜表面模式識別受體TLR2、TLR4和Dectin-1的表達增強,促進宿主對曲霉的識別,進而殺滅曲霉。但這種表達的增強同樣不隨伏立康唑濃度的倍增而持續遞增,在伏立康唑濃度為4 μg/mL、4 μg/mL、1 μg/mL時,TLR2、TLR4和Dectin-1的表達分別達到峰值。

出現這種情況的原因,推測與高濃度的伏立康唑對細胞的毒性作用有關。文獻報道,伏立康唑濃度達100 μg/mL以上時會降低小鼠成骨細胞和成纖維細胞的生長[25]。伏立康唑濃度≥100 μg/mL時增加人角膜內皮損傷的風險。本研究結果顯示,濃度64 μg/mL伏立康唑聯合滅活煙曲霉菌液作用于巨噬細胞12～24 h,表現出明顯的細胞抑制作用,證實高濃度伏立康唑對THP-1來源巨噬細胞具有的毒性作用。推測伏立康唑濃度高達64 μg/mL時導致THP-1來源巨噬細胞免疫活性的下降,引起炎癥因子釋放減少以及細胞膜表面模式識別受體表達減少。

本研究結果提示,對于需要長期口服伏立康唑治療的曲霉病患者,適當濃度的伏立康唑可能更有利于促進患者巨噬細胞的免疫活性。宿主的免疫機制與曲霉的感染之間的關系錯綜復雜,涉及多種細胞及不同的作用機制,本研究僅進行了初步探討。進一步對相關免疫細胞及其機制進行深入研究,將為臨床工作提供更加有力的理論依據。