醛脫氫酶2 與人類疾病的關系及其小分子激動劑研究

孫湘沛，高 興，趙鳳平，王文濤，張天亦，田 巍，鄭燦輝，陳 新 （.武漢輕工大學生命科學與技術學院, 湖北 武漢 43003；.海軍軍醫大學藥學系, 上海 00433；3.中部戰區總醫院, 湖北 武漢 430070）

1 ALDH2 的結構功能和突變

醛脫氫酶（ALDH）是I 相反應中非常重要的氧化酶超家族之一，由一組NAD+依賴性酶組成，主要作用是不可逆的催化內源性和外源性醛，避免醛在人體內蓄積中毒[1]。在哺乳動物組織中均存在ALDH，其中肝臟表達水平最高，其次是腎臟、子宮和大腦，目前在人體內發現了19 種不同的ALDH[2]。ALDH2 是已知的19 種ALDH 中分布最廣泛和表達最高的同工酶，是一種具有相同亞基的四聚體蛋白（圖1），由位于12 號染色體長臂（12q 24.2）上的ALDH2 基因編碼而成的517 個氨基酸組成。其亞基均是由3 個結構域組成：催化結構域、NAD+結合結構域和寡聚結構域[3]（圖1）。

圖1 ALDH2 結構示意圖

ALDH2 是對體內外活性醛代謝的最重要的一種酶，因其對酒精代謝解毒而聞名[4]。ALDH2 代謝的活性醛主要有乙醛、丙烯醛、3,4-二羥基苯乙醛（DOPAL）、丙二醛（MDA）和4-羥基壬烯醛（4-HNE）等[5,6]。其中很重要的是4-HNE，它是由人體脂質過氧化反應時活性氧（ROS）攻擊雙分子層細胞膜上的多不飽和脂肪酸而生成的有毒醛類物質，是目前研究最多的生物活性醛類物質之一[7,8]。脂質過氧化以及它產生的4-HNE 與許多疾病的發生有關，ALDH2 能有效清除這些醛，因此是人體內重要的抗氧化應激損傷因子之一，越來越多被關注和研究。

ALDH2 基因具有多態性,易發生基因突變，其點突變命名為ALDH2*2，是人類最常見的基因突變之一。全球估計有5.6 億人（約占世界人口的8%）都攜帶這種基因，尤其在東南亞人群中約有35%～45%為攜帶者。攜帶者分布中心位于我國南部地區，特別是我國長汀縣約有65%的人口攜帶這種突變基因[9]。造成這種基因突變的原因是ALDH2 基因在12 外顯子42 421 堿基上腺嘌呤取代鳥嘌呤，從而在轉錄翻譯成ALDH2 時其487 位點的谷氨酸被賴氨酸（Glu 487 Lys）取代（圖1），從而導致ALDH2 結構不穩定以至活性降低。通常，ALDH2 野生型和變異型等位基因有3 種類型：野生型純合子（ALDH2*1/*1）、雜合子（ALDH2*1/*2）和變異型純合子（ALDH2*2/*2）。由于突變對編碼ALDH2*1 等位基因的野生型單體產生顯性影響，所以凡是攜帶這種突變基因的人ALDH2 活性均有所下降，ALDH2*1/*2 相比于ALDH2*1/*1 活性降低約50%，而ALDH2*2/*2 活性幾乎完全喪失[10]。

2 ALDH2 和氧化應激損傷相關疾病

ALDH2 是人體內重要的抗氧化應激損傷因子，突變基因攜帶者會增加與活性氧介導的氧化應激損傷相關疾病的風險。氧化應激損傷將導致脂質過氧化，這一過程會產生毒性醛，引發細胞穩態受損、酶失活、DNA 損傷和細胞死亡，從而導致或加劇疾病的發生。研究不斷發現與ALDH2 密切相關的氧化應激損傷相關疾病，如心血管疾病、神經退行性疾病、肝臟疾病、癌癥、糖尿病、范可尼貧血、骨質疏松癥、疼痛等[3]，下面將重點介紹最常見的幾類疾病的相關研究。

2.1 心血管疾病

心血管疾病是全球發病率以及死亡率最高的疾病，這其中主要包括心肌梗死、心臟肥厚和心力衰竭。研究發現，這些疾病的發生均與ROS 誘導的應激損傷有關，ROS 能使生物膜中的多不飽和脂肪酸過氧化，產生活性醛，從而影響人心肌的正常功能[11-13]。研究表明，心肌缺血再灌注損傷（IRI）與急性缺血性腦卒中（AIS）均與氧化應激產生過度4-HNE 有關，而ALDH2 是醛代謝解毒主要依賴，所以ALDH2 介導的活性醛解毒是一種缺血再灌注損傷的內源性保護機制[14]。

近期研究發現，ALDH2 還與心律失常相關。心房顫動（AF）是最常見的心律失常，其特征是過快的心房激活，不同步的心房收縮和不規則的心室率[15]。研究發現，ALDH2 在 AF 相關氧化應激反應中發揮心臟保護作用，同時ALDH2 活性降低將導致AF 的閾值水平低下，導致AF 易感性增加。ROS 誘導脂質過氧化產生活性醛，同時活性醛反過來會觸發更高的ROS 水平，ROS 與醛類物質均可能導致心律失常。過量的ROS 產生主要離子效應、肌細胞電偶聯和異常分子機制的影響而與房顫相關，而活性醛會導致心肌細胞內ATP 濃度嚴重下降，并引起與心律失常發展有關的電生理變化，也能顯著抑制大鼠心室肌細胞內向整流鉀電流（IK1）從而觸發AF[16]。ALDH2 與心律失常有著緊密聯系，由于ALDH2 對ROS 與醛類物質均有抑制作用，所以激動ALDH2 抗心律失常治療途徑可能有較好前景。

2.2 神經退行性疾病

神經退行性疾病是由神經元或其髓鞘失去正?；钚詫е碌模S年齡增長越來越嚴重，從而出現功能障礙，這其中最常見的是帕金森?。≒D）和阿爾茨海默?。ˋD），它們的特征均是氧化應激誘導的脂質過氧化、線粒體功能障礙和醛產物的積累導致記憶喪失、認知能力下降和神經退行性變[3]。

PD 是由黑質多巴胺能神經元缺失引起。大量研究表明，黑質多巴胺能神經元與強活性的DOPAL蓄積有關，動物實驗證明DOPAL 是一種神經毒素，注射DOPAL 可誘發帕金森病[17,18]。ALDH2是DOPAL 代謝的關鍵酶，能將DOPAL 轉化為無毒的3,4-二羥基苯乙酸，所以ALDH2 被認為對PD 具有神經保護作用。

AD 是另一種常見的以認知功能障礙為特征的神經退行性疾病。一些研究表明ALDH2 與AD 的發生有關，Ohsawa 等[19]建立了攜帶ALDH2*2 基因小鼠模型，發現由于ALDH2 活性下降，小鼠的tau 蛋白過度磷酸化而導致的4-HNE 積累，使小鼠顯示出與人類AD 相似的年齡依賴性記憶障礙和神經病理。尸檢報告發現，AD 患者的顳皮層和殼核中的ALDH2 活性明顯高于健康對照組，這可能是因為AD 患者大腦的ROS 誘導氧化應激以至醛的增加，ALDH2 活性的升高是為促進醛的代謝[20]。因此，較高的ALDH2 活性被認為對AD 的存活具有保護作用。

2.3 肝臟疾病

肝臟疾病，包括非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）、肝炎、酒精性肝?。ˋLD）、藥物性肝損傷（DILI）和原發性膽道膽管炎（PBC）等，每年全世界約有200 萬人死于該類疾病。有研究表明肝臟是ALDH2表達水平最高的器官，也是乙醇代謝的主要部位，而ALDH2 是乙醇代謝的主要酶。此外，過量飲酒可增加細胞色素P450 2E1（CYP2E1）的表達和活性，CYP2E1 的活化會促進ROS 的形成進而導致乙醛的產生[21]。ALDH2 活性對肝臟的影響是復雜的， ALD 發生是長期大量飲酒導致的，這在很大程度上受到ALDH2 變異的影響，ALDH2 活性降低導致乙醇代謝過程中乙醛在肝臟蓄積，從而導致ALD。其他NAFLD、肝炎、DILI 和PBC 也均與ROS 誘導的氧化應激有關，在這些肝臟疾病中ROS 升高導致肝臟細胞脂質過氧化產生4-HNE。一組體內實驗表明，敲除ALDH2基因將加重肝臟疾病，而相應提升ALDH2 的表達水平可以延緩疾病進一步發展[22]。

2.4 癌癥

研究表明，ALDH2 與許多癌癥發生有關，如肝癌、結直腸癌、胃癌、食管癌、肺癌、膀胱癌等。乙醛、4-HNE 和MDA 等有毒物質，在細胞中的積累會引起醛類誘導的DNA 鏈間交聯，從而進一步誘導這些癌癥的發生和發展[23,24]。對于龐大的ALDH2*2 攜帶人群來說，ALDH2 低活性更易引起毒性醛的蓄積，患上癌癥風險更大。同時研究也證實了ALDH2 在大多數腫瘤中相對于正常組織表達水平上存在缺陷，此外，ALDH2 的缺失往往提示惡性表型和不良預后，有助于提高癌癥患者的準確診斷和及時干預[25]。對于攜帶ALDH2*2 癌癥患者，可能不僅ALDH2 活性低導致毒性醛蓄積誘導癌癥的發展，還可能因患有癌癥使得患者ALDH2表達降低，這種雙重效應使得患者癥狀加重。鑒于此，對于與ALDH2 相關的癌癥，可將ALDH2 作為新的靶點，激動ALDH2 活性是一個可能的新治療方法[26]。

2.5 新型冠狀病毒感染

近些年新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起的新冠肺炎持續大流行，在全球范圍內造成嚴重的公共衛生威脅。現在對其治療的方式大多還是以疫苗的預防作用為主，提前接種能夠在很大程度上避免重癥和死亡[27]。近幾年的研究發現，ALDH2 基因rs671 多態性可能與免疫系統存在一些聯系。隨后在最新研究中發現ALDH2基因突變攜帶者在接種疫苗前后4 個月，其體內SARS-CoV-2 刺突蛋白S1 IgG 水平與rs671 變異等位基因數量呈負相關。該研究結果首次表明了ALDH2 的變異等位基因rs671 與COVID-19 mRNA疫苗的免疫原性減弱有關[28]。因此，對突變基因攜帶者來說，提高ALDH2 活性可能可以輔助疫苗作用，加強疫苗在病毒免疫應答流程快速產生抗體，這將對新冠后時代提供一個新的解決方式。

3 ALDH2 與鐵死亡

鐵死亡是近年來發現的一種鐵依賴的、非凋亡的新型細胞死亡模式，在其發生過程中通常伴有大量鐵積累和脂質過氧化，其中最主要特征是累積大量ROS[29]。近期研究發現，在某些疾病發生時ALDH2 與鐵死亡之間存在著一些聯系，在一定程度上，鐵死亡的發生將使得細胞中ALDH2 的表達減少，提高ALDH2 活性能夠減少細胞鐵死亡。

急性肺損傷（ALI）是敗血癥的常見并發癥，在2022 年Cao 等[30]采用盲腸結扎穿刺法（CLP）建立膿毒癥所致小鼠肺損傷模型，經過CLP 處理的小鼠肺組織形態遭到破壞，脂質過氧化損傷，鐵含量增加，肺環加氧酶2（PTGS2）蛋白表達增加，同時谷胱甘肽過氧化酶4（GPX4）蛋白表達減少，還下調了ALDH2 的表達。而在對照組，加入ALDH2 激動劑處理后，發現ALDH2 表達增加，肺損傷減輕，ROS 水平降低，組織鐵含量和PTGS2 蛋白表達降低，GPX4 蛋白表達升高，這表明了ALDH2 的激活能抑制鐵死亡。另一組加入鐵死亡抑制劑鐵抑素Fer-1 處理組，ALDH2 蛋白表達增加，鐵死亡被抑制也促進ALDH2 的表達。這些研究表明在急性肺損傷中ALDH2 和鐵死亡存在很大聯系。

最近研究發現，在臨床相關心臟驟停（CA）和心肺復蘇（CPR）后的肺損傷存活豬模型中，均觀察到肺鐵死亡，其表現為鐵過量和醛產物增加，抗氧化劑減少。然而，當使用ALDH2 激動劑處理的CA/CPR 組，肺鐵含量和醛產物均降低了，同時抗氧化劑增加。ALDH2 激動劑能夠抑制鐵死亡并有效緩解CA/CPR 后的肺損傷，其可能是ALDH2激動劑治療緩解CA/CPR 后肺損傷的作用機制[31]。Yu 等[32]發現CPR 后腎和腸損傷豬模型中，腎臟和腸道細胞發生鐵死亡，其腎臟和腸道中鐵過量，MDA 和4-HNE 含量及?；o酶A 合成酶長鏈家族成員4（ACSL4）表達顯著增加，GPX4 表達顯著降低，然而用ALDH2 激動劑處理的CPR 組，上述變化顯著逆轉，鐵死亡得到有效的抑制。由此可見，ALDH2 激動劑處理可通過抑制細胞鐵死亡來緩解CPR 后腎臟和腸道損傷。

近期Zhu 等[33]針對阿爾茨海默病APP/PS1 小鼠模型，發現ALDH2 能通過抑制ACSL4 依賴的鐵死亡從而緩解由AD 引起的心血管功能障礙，結果還表明ALDH2 可通過調節脂質過氧化和鐵死亡在AD 誘導的心臟異常中起重要保護作用。

綜上所述，鐵死亡與ALDH2 之間的關系密切，但以上聯系的具體機制仍有待進一步研究。目前鐵死亡相關疾病的研究還有很多，涉及神經系統、心臟、肺部、腎臟、胰腺疾病等[34]。如果能夠進一步明確ALDH2 與鐵死亡在生物作用機制上有直接關系，那提高ALDH2 活性對鐵死亡相關疾病的患者將是一種新的可能治療手段。

4 ALDH2 小分子激動劑

ALDH2 是人體氧化應激損傷防護的重要環節，提高ALDH2 活性具有重要意義，對人數眾多的突變基因攜帶者尤其重要。提高ALDH2 活性有利于氧化應激損傷導致的毒性醛的代謝，具有降低心血管疾病、神經退行性疾病、癌癥、肝臟疾病等的患病率的潛在作用，同時也可能改善這些疾病預后。最近研究又表明，提高ALDH2 活性在某些疾病中能夠緩解鐵死亡。因此，ALDH2 逐漸成為相關疾病治療的潛在靶點。最近十多年，研究報道了多個類型的小分子激動劑，不過總體來說仍處于研究起步階段。

2008 年Chen 等[12]首次通過高通量篩選發現小分子Adla-1, 它能有效的對ALDH2 野生型和ALDH2*2 突變型產生激活作用。在體外實驗中，Alda-1 能將失活變體ALDH2*2 激動活性最高提高至10 倍，同時也能最大程度的提高野生型ALDH2 的活性至2 倍。在體內實驗中，能使缺血性腦損傷大鼠減少60%的梗死面積。研究證明，Alda-1 與ALDH2 催化區伸向蛋白表面的入口部位結合（圖1），通過變構效應穩定ALDH2 的結構從而發揮激動作用[35]。但是Alda-1 的水溶性較差，且生物活性也有待提高（圖2）。

圖2 已報道的ALDH2 小分子激動劑

針對Alda-1 存在的問題，為了得到生物活性與水溶性更好的ALDH2 激動劑，2018 年本課題組Hu 等[36]直接對Alda-1 進行了結構修飾，以期提高它們的水溶性和生物活性。在合成所得到的三類新化合物中，化合物的水溶性均有所提高，其中兩類化合物表現出較好的激動活性，其中化合物I-6 活性最好。而后2020 年Cheng 等[37]鑒于Alda-1 構效關系不完善以及活性不佳等問題，也對Alda-1 進行了結構改造，設計并合成了系列Alda-1 類似物，其中部分目標化合物的活性高于Alda-1，活性最好的化合物為3k。2021 年，Lee 等[38]研究發現了一種新的ALDH2 激動劑AD-9 308（結構未公開），它比Alda-1 活性更好，且有較好水溶性和高選擇性。研究發現AD-9 308 在治療由4-HNE 介導的糖尿病引起的心肌病時，能有效地激活ALDH2，從而降低糖尿病小鼠的血清4-HNE 水平和心臟組織中的4-HNE 蛋白加合物，同時改善心肌纖維化、炎癥和細胞凋亡。這一研究結果表明了ALDH2 激活對4-HNE 介導疾病的治療潛力，也表明了對新的ALDH2 激動劑研發的重要性。

2021 年，Chen 等[39]發現厚樸中一種天然活性分子厚樸酚（Magnolol），能通過激動ALDH2 活性從而抑制心臟成纖維細胞的增殖和膠原合成，進而抑制心肌纖維化，且有助于預防心血管疾病，包括心力衰竭。雖然其精確作用機制尚不清楚，不論作用位點是否與Alda-1 一致，鑒于其源于天然產物，為ALDH2 激動劑的發現提供了一個新方向。

2021 年，本課題組通過計算機模擬篩選發現了一類全新骨架的ALDH2 激動劑N-芐基苯胺類化合物C6[40]，其在體外ALDH2 活性實驗中最大激動倍數為Alda-1 的104%，在體內能使缺血性腦損傷大鼠模型減少約70%的梗死面積。該化合物的發現首先是通過兩輪模擬篩選、基于藥效團和結構平行篩選以及基于命中化合物的子結構搜索，發現N-芐基苯胺對ALDH2 有激動活性，然后對其進行了結構優化，最終得到了具有良好體內外活性的化合物C6。

5 結論

ALDH2 不僅與氧化應激損傷相關疾病存在聯系，也和鐵死亡相關疾病存在間接聯系，雖然有些機制尚不明確，但毫無疑問把ALDH2 作為治愈或緩解相關疾病的靶點，是很有前景的。原因有兩點，第一是在一些體內外實驗中已經證明了激動ALDH2 活性確實能夠緩解相關疾病癥狀，而如果針對這些疾病以前的藥物靶點存在耐藥性或藥效不好的問題，ALDH2 不乏是一個全新的選擇；第二是ALDH2 基因突變的攜帶者廣泛存在，特別是東亞人，對于這類人更易因為內源性醛的蓄積從而加重一些疾病的癥狀，激活ALDH2 能夠輔助相應疾病的治療。目前，ALDH2 小分子激動劑的研究還比較有限，報道的激動劑還存在結構類型少、生物活性不高和成藥性有待提高等諸多問題。期望隨著研究的深入，未來會有更多、更好的ALDH2小分子激動劑問世。