具有三光子性質(zhì)的碘代咔唑基三吡啶錳（Ⅱ）配合物的合成及光動(dòng)力學(xué)活性

張 瓊，李雅琴，劉玲玲，蔡昌婷，喬 瑞，宣 俊*

(1.安徽大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，功能無(wú)機(jī)材料化學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230601；2.阜陽(yáng)師范大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 236037)

配合物非線性光學(xué)材料在上世紀(jì)八十年代以后迅速發(fā)展,成為科研人員關(guān)注的熱點(diǎn)課題[1]。由于金屬原子本身具有不同的d 或f 電子數(shù)、不同的氧化數(shù)和配位數(shù)，配體結(jié)構(gòu)也具有多樣性，這使得形成的非線性光學(xué)材料具有獨(dú)特的光電性能。因此相對(duì)于單純的無(wú)機(jī)或者有機(jī)非線性光學(xué)材料有著更多的優(yōu)勢(shì)[2]。除此之外，配合物的吸收譜帶較多，分子內(nèi)部存在著光子從配體到中心金屬離子的躍遷以及從中心金屬離子到配體的躍遷，這使得配合物的基態(tài)偶極化和極化率較大，基態(tài)與激發(fā)態(tài)之間的能級(jí)差則相對(duì)較小。這一特點(diǎn)可以提高配合物非線性光學(xué)材料光電響應(yīng)的速度，通過(guò)將配體設(shè)計(jì)成具有一定結(jié)構(gòu)特征的新型配體，使這一類型的材料得到進(jìn)一步的發(fā)展[3-5]。

光敏劑是指在光化學(xué)反應(yīng)中，通過(guò)將光能轉(zhuǎn)移到一些對(duì)可見(jiàn)光不敏感的反應(yīng)物上來(lái)提高感光性能的物質(zhì)[6]。性質(zhì)優(yōu)良的光敏劑通常具有以下特點(diǎn)：1）純度較高的單一化合物；2）穩(wěn)定性良好；3）熒光一般處在近紅外區(qū)；4）三重態(tài)量子產(chǎn)率比較高；5）分子的暗毒性小，光毒性大；6）具有較好的靶向性，并且容易被人體組織吸收[7-11]。本文引入鹵素離子來(lái)修飾配體，目的在于增加配合物分子的光敏活性，讓配合物更好的應(yīng)用于光動(dòng)力學(xué)治療中。

錳是第四周期的過(guò)渡金屬，是生物體必須的微量元素之一，它的最外層電子結(jié)構(gòu)是d5，5 個(gè)單電子分別占據(jù)五個(gè)3d 軌道，處于半充滿的狀態(tài)[12]。近年來(lái)，錳（Ⅱ）配合物由于其優(yōu)越的光電性能引起了科研人員的廣泛關(guān)注，對(duì)比銥（Ⅲ）、鉑（Ⅱ）、金（Ⅰ）等貴金屬配合物，錳（Ⅱ）配合物表現(xiàn)出類似的長(zhǎng)壽命磷光發(fā)射和高發(fā)光量子效率，并且具有成本低，毒性小的優(yōu)點(diǎn)，在光電功能材料領(lǐng)域逐漸占據(jù)一席之地[13-17]。

本文圍繞一種咔唑基三吡啶錳（Ⅱ）配合物MB3 進(jìn)行了一系列探討。具體的設(shè)計(jì)思路如下：1）咔唑基三吡啶作為一種三齒配體，可以與Mn螯合形成穩(wěn)定的配位化合物，使得形成的配合物表現(xiàn)出較好的非線性光學(xué)性質(zhì)[18-19]。2）引入碘原子，可以改善分子間體系的交叉過(guò)程，使得配合物的ROS 產(chǎn)率得到提高[20]。3）金屬中心的引入可以促進(jìn)配合物的非線性光學(xué)性質(zhì)[21]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑：2-乙酰基吡啶、乙醇、氫氧化鉀、中間體A3、氨水、飽和MnCl2溶液等。所有溶劑均為分析純，并且已按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行了純化和干燥。

儀器：核磁共振譜儀（JNM-ECZ400S,TMS 為內(nèi)標(biāo)）；傅立葉紅外顯微系統(tǒng)（Vertex80+Hyperion 2000，KBr 壓片）；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（LTQ Orbitrap XL）；紫外分外光度計(jì)（U-3900 Spectrophotometer）；熒光分光光度計(jì)（F-7000 FL Spectrophotometer）；超高分辨率激光共聚焦顯微鏡（TCS SP8 STED 3X）；全自動(dòng)協(xié)調(diào)飛秒激光器Coherent Astrella+TOPAS Prime (1 100-2 600 nm,1 kHz,120 fs)。

1.2 配體B3 及配合物MB3 的合成路線

圖1 配體B3 及配合物MB3 的合成路線

配體B3 的合成：稱取2-乙酰基吡啶（2.6 g，0.022 mol）加入500 mL 的圓底燒瓶中，用適量的乙醇溶液溶解，稱取氫氧化鉀（1.2 g,0.023 mol），用少量的水溶解后加入上述圓底燒瓶，常溫?cái)嚢?0 min。稱取A3（4.4 g，0.01 mol），用乙醇溶液溶解后加入體系，攪拌15 min，用恒壓滴液漏斗將40 mL 左右的氨水逐滴滴入體系中，80 ℃回流4 h，停止加熱，旋干溶劑，用乙醇分散后即可析出棕黃色固體。1H NMR (400 MHz,d6-CD3COCD3) δ 8.92 (s,2H),8.79 (dd,J=1.9,0.5 Hz,1H),8.75(dd,J=1.8,0.9 Hz,1H),8.74 (t,J=1.0 Hz,1H),8.73-8.72 (m,1H),8.04 (dd,J=8.6,1.9 Hz,1H),8.01-7.95 (m,2H),7.73 (ddd,J=9.0,8.6,1.1 Hz,2H),7.67-7.59 (m,1H),7.57 (s,1H),7.47-7.41(m,3H),4.30 (d,J=7.6 Hz,2H),1.45-1.18 (m,15H).13C NMR (100 MHz,d6-CDCCl3) δ 156.67,155.95,150.88,149.24,141.79,140.09,136.94,129.70,128.70,125.93,124.78,123.84,123.51,122.45,121.49,119.57,118.82,112.13,110.74,109.67,39.45,31.11,28.87,28.60,24.45,23.09,14.10,11.12.IR (KBr,cm-1): 2952,2630,1647,1397,1010,834,705.ESI-MS m/z: calcd for: M:636.17,found:637.18[M+H+].

配合物MB3 的合成：稱取配體B3（63.7 mg，0.10 mmol）于無(wú)水乙腈中，加熱使其溶解，將上述配體溶液逐滴滴加到溶于無(wú)水乙腈的飽和MnCl2溶液中，常溫?cái)嚢?0 min 后收集黃色固體。Mp:357-359℃。IR (KBr,cm-1): 3427，2936，2364，1600，1473，1100，864，800，717，673.MALDITOF-MS m/z:calcd for:M:761.05,found:761.27.

2 光物理性質(zhì)

2.1 紫外-可見(jiàn)吸收光譜與單光子熒光光譜

選取DMSO 作為溶劑，測(cè)定MB3 的單光子吸收和發(fā)射光譜，探究配合物MB3 吸收能量后的電子躍遷行為以及激發(fā)態(tài)回落時(shí)的發(fā)光現(xiàn)象。測(cè)定結(jié)果如下：

如圖2（a）所示，配合物MB3 在280～300 nm處表現(xiàn)出較高的吸收，此峰歸屬于配合物分子內(nèi)部的π-π*躍遷；在300～350 nm 處表現(xiàn)出相對(duì)較弱的吸收，此峰歸屬于配體分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）；在380 nm 附近的吸收是配合物的中心金屬離子Mn(Ⅱ)到配體的電荷轉(zhuǎn)移（1MLCT）。如圖2（b）所示，MB3 在440 nm 左右表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光。

圖2 （a）MB3 的紫外-可見(jiàn)吸收光譜（b）MB3 的單光子熒光光譜（測(cè)試濃度：10-5mol/L）

2.2 三光子熒光光譜

實(shí)驗(yàn)采用熒光對(duì)比法在1 150～1 550 nm 的飛秒激光激發(fā)下測(cè)試了配合物的三光子熒光光譜，進(jìn)一步研究配合物MB3 的非線性光學(xué)性質(zhì)。以羅丹明6 G 作為標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算公式如下：

下標(biāo)“s”和“r”分別代表樣品和參比（參比溶液是溶于乙醇的10-3mol/L 的羅丹明6 G）。f 為光纖光譜儀采集到的熒光信號(hào)的整體熒光收集效率強(qiáng)度。Q,n,c 分別為熒光的量子產(chǎn)率，溶劑的折射率，溶液的濃度。測(cè)試結(jié)果如下：

由圖3（a）可知，配合物MB3 在1 150-15 50 nm 的激發(fā)下具有明顯的三光子熒光信號(hào)。隨著激發(fā)波長(zhǎng)增加，配合物的熒光先增強(qiáng)后又減弱。在激發(fā)波長(zhǎng)為1 450 nm 時(shí)，配合物的三光子熒光強(qiáng)度達(dá)到峰值。將配合物MB3 的三光子發(fā)射位置與單光子發(fā)射位置對(duì)比后，發(fā)射位置出現(xiàn)了接近100 nm 的紅移。根據(jù)上述公式計(jì)算得到MB3在1450 nm 激發(fā)下，其的三光子吸收截面達(dá)到2.2×10-79cm6s2photon-2，表明配合物MB3 具有較強(qiáng)的三光子吸收性質(zhì)。

圖3 (a)MB3 的三光子激發(fā)熒光光譜；（b）三光子吸收截面（a/b,測(cè)試濃度10-3mol/L）

3 生物應(yīng)用探索

3.1 活性氧檢測(cè)與細(xì)胞毒性測(cè)試

考慮到碘原子引起的重原子效應(yīng)，研究了配合物MB3 的活性氧（ROS）生成能力。2,7-二氯二氫熒光素二乙酸（H2DCF-DA）是商用指示劑，本身是不帶有熒光的，但經(jīng)過(guò)氫氧化鈉活化半個(gè)小時(shí)后會(huì)水解產(chǎn)生HDCF，HDCF 與ROS 反應(yīng)生成DCF,發(fā)出熒光。如圖4（a）和（b）所示，光照條件下，指示劑在520 nm 左右發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光，隨著時(shí)間推移熒光強(qiáng)度逐漸變大，表明配合物MB3 能夠生成ROS，并且生成ROS 的速度較快。繼續(xù)探索了生成活性氧的種類，使用Bruker NanoX 波段光譜儀，在298 K 條件下對(duì)配合物MB3 進(jìn)行了ESR 測(cè)定。如圖4（c）所示，光照條件下，MB3 在空氣飽和的水溶液中記錄了特征信號(hào)，沒(méi)有光照則未能檢測(cè)到特征信號(hào)。光照后在3 600 G 和3 460 G 之間觀察到相對(duì)強(qiáng)度為1:1:1的特征單線態(tài)氧三元組信號(hào)，表明光照條件下，配合物MB3 產(chǎn)生的ROS 的種類為1O2。

圖4 （a）在525 nm PBS 光照射下，MB3 存在下的H2DCFDA 的熒光強(qiáng)度（b）525 nm PBS 光照射下，MB3 產(chǎn)生的ROS（c）光照前后，TEMP 捕獲MB3 的ESR 信號(hào)(c=1.0×10-3 mol/L)（d）配合物在HeLa 細(xì)胞中的毒性測(cè)試

上述測(cè)試結(jié)果表明，MB3 有作為光敏劑的潛力，進(jìn)一步進(jìn)行了相關(guān)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。如圖4（d）所示，黑暗條件下，不同濃度的MB3 與HeLa 細(xì)胞孵育培養(yǎng)24 h 后細(xì)胞的存活率仍然保持在80%以上，表明配合物MB3 暗毒性較低；光照條件下，細(xì)胞的存活率則有著明顯的下降趨勢(shì)，細(xì)胞存活率隨著MB3 濃度增大而逐漸減小。由此可知，配合物MB3 具有較低的暗毒性和較高的光毒性，具有良好的光動(dòng)力學(xué)應(yīng)用前景。

3.2 細(xì)胞內(nèi)的ROS 檢測(cè)

利用商用ROS 熒光探針2,7-二氯-氫熒光素（DCFH-DA）觀察ROS 的產(chǎn)生。DCFH-DA 進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)存在的酯酶水解，生成對(duì)ROS敏感的探針DCFH，DCFH 與ROS 快速反應(yīng)生成熒光化合物2,7-二氯熒光素（DCF）。因此，可以通過(guò)DCF 的熒光強(qiáng)度來(lái)評(píng)估細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。DAPI 是一種可以穿過(guò)細(xì)胞膜，與DNA 緊密結(jié)合的熒光染料，在358 nm 激光下，復(fù)合物DAPI-DNA 發(fā)出藍(lán)色熒光，可以用于標(biāo)記細(xì)胞核。如圖5 所示，將MB3 和DCFH-DA 孵育HeLa 細(xì)胞30 分鐘，光照條件下，隨著時(shí)間的推移，觀察到明顯的熒光增強(qiáng)現(xiàn)象，表明細(xì)胞內(nèi)具有有效的ROS生成，生物測(cè)試結(jié)果與化學(xué)測(cè)試結(jié)果相一致。

圖5 （a）以DCFH-DA 為指示劑進(jìn)行共聚焦顯影在HeLa細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)ROS 的產(chǎn)生；（b）AM/PI(5 μm)處理MB3(10 μm)體外PDT 療效觀察不同處理后的HeLa 細(xì)胞。

以鈣黃素（AM）和碘化丙啶（PI）為指標(biāo)，直觀評(píng)價(jià)MB3 作為光敏劑時(shí)對(duì)癌細(xì)胞的殺傷效果，以證實(shí)PDT 的高效率。當(dāng)出現(xiàn)鈣黃素的綠色熒光時(shí)，說(shuō)明細(xì)胞狀態(tài)良好；但當(dāng)出現(xiàn)碘化丙啶的紅色熒光時(shí)，說(shuō)明細(xì)胞已經(jīng)死亡。如圖5（b）所示，MB3 孵育HeLa 細(xì)胞30 分鐘后進(jìn)行AM/PI 染色。Vc 能夠抑制ROS 產(chǎn)生過(guò)程，光照后加入Vc組出現(xiàn)綠色熒光，說(shuō)明細(xì)胞未死亡；而PDT 組出現(xiàn)紅色熒光，說(shuō)明癌細(xì)胞已死亡。綜上所述，MB3誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制結(jié)果表明，MB3 產(chǎn)生的ROS破壞癌細(xì)胞使得細(xì)胞死亡。

4 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)合成了一種碘原子修飾的咔唑三吡啶錳配合物MB3，配合物具有良好的非線性光學(xué)性質(zhì)，最大三光子吸收截面可達(dá)到2.2×10-79cm6s2photon-2。ROS 生成和細(xì)胞成像表明MB3 在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外均具有優(yōu)異的單線態(tài)氧生成能力，其細(xì)胞毒性測(cè)試顯示MB3 具有較高的光毒性和較低的暗毒性，光照條件下能夠在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡，具有應(yīng)用于光動(dòng)力學(xué)治療的潛力。