L-茶氨酸延緩應(yīng)激條件下秀麗隱桿線蟲(chóng)的衰老

杜召鳳，李怡霏，賈 茹，屈長(zhǎng)青,2*

（1.阜陽(yáng)師范大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 236037；2.阜陽(yáng)師范大學(xué) 抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽阜陽(yáng) 236037；3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶樹(shù)生物學(xué)與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036）

衰老是自然界中的一種由不同器官和系統(tǒng)一系列特定變化所產(chǎn)生的復(fù)雜的生命現(xiàn)象，它是生命運(yùn)動(dòng)的自然過(guò)程[1]。生命體生存周期的延長(zhǎng)通常是與機(jī)體對(duì)外界的抗脅迫能力相關(guān)。常見(jiàn)的脅迫環(huán)境有熱應(yīng)激、氧化應(yīng)激、紫外應(yīng)激等。衰老是每一個(gè)生命體都不可避免的自然現(xiàn)象，但是隨著對(duì)生命科學(xué)探索的逐漸深入，以及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，一些抗衰老藥物可以做到一定程度地延緩衰老[2]。古往今來(lái)，人們對(duì)于延緩衰老延長(zhǎng)壽命的探尋從未停止，隨著我國(guó)社會(huì)人口老齡化的嚴(yán)重，對(duì)于抗衰老機(jī)制及抗衰老藥物的研發(fā)已成為當(dāng)前生命科學(xué)研究的重要課題[3]。

茶氨酸是茶葉中特有的氨基酸[4],其主要分布在茶葉的嫩枝、子葉和根中，存在兩種同分異構(gòu)體，分別為L(zhǎng) 型和D 型茶氨酸，研究中所用到的L型茶氨酸為游離形式天然氨基酸，具有抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護(hù)、抗癌、抗焦慮、代謝調(diào)節(jié)、心血管保護(hù)、肝和腎保護(hù)以及免疫調(diào)節(jié)等作用[5-8]，是我國(guó)批準(zhǔn)的新食品原料[9]。目前有關(guān)茶氨酸抗衰老研究的模型動(dòng)物有小鼠、家禽，但是以線蟲(chóng)為模型研究應(yīng)激條件下的茶氨酸抗衰老功效較少。本實(shí)驗(yàn)以秀麗隱桿線蟲(chóng)為模式生物，采用熱應(yīng)激與氧化應(yīng)激兩種脅迫條件，研究L-茶氨酸對(duì)于改善各種應(yīng)激引起的秀麗隱桿線蟲(chóng)抗氧化逆境的作用，為L(zhǎng)-茶氨酸抗逆境、抗衰老產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

1.1.1 材料

L-茶氨酸（純度≥98%），購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；秀麗隱桿線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans,C.elegans），包括野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)（Bristol strain N2）以及轉(zhuǎn)基因品系TJ375[hsp-16:GFP]，由阜陽(yáng)師范大學(xué)抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心提供；大腸桿菌E.coli0P 50由阜陽(yáng)師范大學(xué)抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.2 主要試劑及配制

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（catalase,CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。

M9 緩沖液(1L)：稱取3.0 g 磷酸二氫鉀，6.0 g磷酸氫二鈉，5.0 g 氯化鈉，0.25 g 七水硫酸鎂，加入去離子水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌20 min，4 ℃冰箱保存[10]。

裂解液(100 ml):取5 mol·L-1氫氧化鉀溶液和10%次氯酸鈉溶液各10 mL，定容至100 mL[11]。

NGM-OP50 培養(yǎng)基[12]（1 L）：稱取3.0 g 氯化鈉，17.0 g 瓊脂，2.5 g 蛋白胨，975 mL 蒸餾水，25 mL 磷酸鹽緩沖溶液，121 ℃高壓滅菌20 min 后，再加入硫酸鎂、氯化鈣以及膽固醇溶液。待冷卻后，涂布100μLE.coliOP50于平板上。

1.1.3 儀器設(shè)備

培養(yǎng)箱（上海一恒科技儀器有限公司）；普通冰箱（中國(guó)海爾集團(tuán)有限公司）；倒置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 有限公司）；超凈工作臺(tái)（中國(guó)ESCO 公司）；恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；TDL80-2B 臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；高壓滅菌鍋（日本HIRAYAMA 公司）；振蕩培養(yǎng)箱（金壇市白新寶儀器廠）；紫外分光光度計(jì)（上海滬西分析儀器廠有限公司）；超純水儀（美國(guó)Millipore 有限公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 線蟲(chóng)的培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

將5 d 齡體內(nèi)帶卵的線蟲(chóng)用M9 緩沖液沖下，進(jìn)行同期化處理，20 ℃培養(yǎng)12 h，得到L1 期線蟲(chóng)，將其接種到NGM-OP50 培養(yǎng)基上，20℃培養(yǎng)48～54 h，即得到用于實(shí)驗(yàn)的L4 期線蟲(chóng)，將其分為對(duì)照組和處理組，處理組用L-茶氨酸進(jìn)行干預(yù)，同時(shí)根據(jù)Zarse K 等人[13]的研究，設(shè)置濃度分別為0.1、1、10μmol·L-1。分別用CD、LD、MD、HD 表示對(duì)照組、L-茶氨酸低劑量組、L-茶氨酸中劑量組、L-茶氨酸高劑量組。

1.2.2 移動(dòng)力測(cè)定

建筑面積的大小是影響造價(jià)成本波動(dòng)的根本因素。對(duì)于建筑面積較小的工程，工程造價(jià)成本的預(yù)估難度相對(duì)來(lái)說(shuō)就小很多，且預(yù)估造價(jià)與最終決算費(fèi)用的誤差也較小。而對(duì)于建筑面積較大的工程，受建筑材料、人工費(fèi)用等因素價(jià)格波動(dòng)影響，其最終的造價(jià)成本預(yù)估也較難控制。

收集同期化野生型N2 線蟲(chóng)培養(yǎng)8 d，各組隨機(jī)選取100 條，記錄線蟲(chóng)的移動(dòng)能力。線蟲(chóng)的移動(dòng)力測(cè)定方法參考劉星雨[14]等人的方法，具體標(biāo)準(zhǔn)為：①秀麗隱桿線蟲(chóng)自發(fā)運(yùn)動(dòng)，不需要觸碰刺激，記為A；②秀麗隱桿線蟲(chóng)必須受到觸碰刺激才運(yùn)動(dòng)，記為B；③秀麗隱桿線蟲(chóng)受到觸碰刺激后只擺動(dòng)頭或尾，記為C。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.3 急性熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

本方法基于龔雨順[15]等人實(shí)驗(yàn)改進(jìn)，同期化野生型N2 線蟲(chóng)培養(yǎng)3 d，隨機(jī)挑取20 條轉(zhuǎn)移至加有M9 溶液的EP 管中，在37 ℃的水浴條件下分別應(yīng)激10、15、20、25 分鐘后觀察并記錄其存活率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.4 TJ375 型線蟲(chóng)的熒光可視化

收集同期化轉(zhuǎn)基因品系TJ375 型線蟲(chóng)培養(yǎng)3天，在35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行熱環(huán)境脅迫處理。熱應(yīng)激1 h 后，轉(zhuǎn)移至20 ℃下恢復(fù)24 h。滴加10μL 左旋咪銼溶液（1 mmol·L-1）麻醉，倒置熒光顯微鏡下觀察線蟲(chóng)體內(nèi)相對(duì)熒光強(qiáng)度，拍攝熒光圖片，利用Image J 軟件分析處理。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.5 H202誘導(dǎo)的急性氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

收集同期化野生型N2 線蟲(chóng)培養(yǎng)3 d，將線蟲(chóng)暴露于10μL 30%的H202中，每隔5 min 觀察并記錄線蟲(chóng)的存活率，直至線蟲(chóng)全部死亡。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.6 氧化應(yīng)激后脂褐素水平的測(cè)定

按照1.2.6 的方法處理線蟲(chóng)，在對(duì)照組的秀麗隱桿線蟲(chóng)半致死時(shí)，即在30%的H202作用10 min時(shí)，挑取存活的線蟲(chóng)進(jìn)行熒光觀察。熒光觀察方法參照王慧[16]等實(shí)驗(yàn)方法改進(jìn)。配制1%濃度的瓊脂糖凝膠，每個(gè)組挑取4～5 條線蟲(chóng)，滴加10 uL左旋咪銼溶液（1 mmol·L-1）麻醉，倒置熒光顯微鏡下，激發(fā)340～380 nm，發(fā)射430 nm，觀察線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素水平，拍攝熒光圖片，利用Image J 軟件分析處理[17]。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.7 線蟲(chóng)抗氧化酶活力的測(cè)定

收集同期化野生型N2 線蟲(chóng)培養(yǎng)8 d，轉(zhuǎn)移至EP 管中，將秀麗隱桿線蟲(chóng)用生理鹽水制備成冰浴勻漿，液氮速凍后解凍，重復(fù)兩次，超聲震碎，4 ℃、8000 r·min-1離心，收集上清液[18]。采用試劑盒測(cè)定線蟲(chóng)體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活力。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。“*”表示P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，“**”表示P＜0.01，存在顯著性差異；“***”表示P＜0.001，存在極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)野生型N2 線蟲(chóng)移動(dòng)力的影響

有研究表明，移動(dòng)能力及對(duì)外界機(jī)械刺激反應(yīng)的退化是測(cè)定秀麗隱桿線蟲(chóng)衰老的一種指標(biāo)[19]。如圖1 所示，線蟲(chóng)培養(yǎng)至第8 天時(shí)，L-茶氨酸可以提高秀麗隱桿線蟲(chóng)的移動(dòng)力，說(shuō)明L-茶氨酸具有提高野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)抗衰老的潛力。

圖1 L-茶氨酸對(duì)線蟲(chóng)移動(dòng)力的影響

2.2 熱應(yīng)激下野生型N2 線蟲(chóng)的壽命

在37 ℃急性熱應(yīng)激情況下，不同濃度茶氨酸對(duì)野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)在10、15、20、25 分鐘時(shí)壽命的影響如圖2 所示，與CD 組相比，HD 組在10、15、20、25 分鐘時(shí)均能提升線蟲(chóng)的存活率（P＜0.05），說(shuō)明10μmol·L-1的L-茶氨酸能夠有效延長(zhǎng)野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)急性熱應(yīng)激下的壽命。

圖2 L-茶氨酸對(duì)熱應(yīng)激下線蟲(chóng)壽命的影響

2.3 熱應(yīng)激下TJ375 型線蟲(chóng)的相對(duì)熒光檢測(cè)

轉(zhuǎn)基因品系TJ375 型線蟲(chóng)受到外界熱應(yīng)激刺激后，會(huì)表達(dá)hsp：gfp 融合蛋白發(fā)揮抗逆性作用[20]，由圖3 可以得出與CD 組相比，HD 組可極顯著降低線蟲(chóng)體內(nèi)的相對(duì)熒光強(qiáng)度，降低比例為46.1%。說(shuō)明L-茶氨酸對(duì)線蟲(chóng)的熱應(yīng)激損傷具有修復(fù)作用。

注：相對(duì)熒光強(qiáng)度即線蟲(chóng)體內(nèi)熱休克蛋白自發(fā)熒光面積與蟲(chóng)體面積之比。*：與對(duì)照組相比，P＜0.05。**：與對(duì)照組相比，P＜0.01。***：與對(duì)照組相比，P＜0.001。##：與L-茶氨酸高劑量組相比，P＜0.01。

圖3 L-茶氨酸對(duì)熱應(yīng)激下TJ375 線蟲(chóng)熒光強(qiáng)度的影響

2.4 L-茶氨酸對(duì)氧化應(yīng)激損傷線蟲(chóng)的影響

如表1 所示，CD 組的最大壽命為17.0 ± 1.7 min，LD 組的最大壽命為22.0±1.7 min，MD 組的最大壽命為25.0 ± 1.7 min，HD 組的最大壽命為31.0±1.7 min。MD 組相對(duì)于CD 組有顯著性差異（P＜0.05），HD 組相對(duì)于CD 組有極顯著差異（P＜0.001）。說(shuō)明L-茶氨酸能夠延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲(chóng)在氧化應(yīng)激下的最大壽命。

表1 L-茶氨酸對(duì)氧化應(yīng)激下線蟲(chóng)最大壽命的影響

2.5 茶氨酸對(duì)氧化應(yīng)激損傷線蟲(chóng)脂褐素含量的影響

線蟲(chóng)體內(nèi)的脂褐素會(huì)隨著年齡增長(zhǎng)而增多，可作為線蟲(chóng)機(jī)體衰老的生物標(biāo)志。由圖4 可知，HD 組秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)的脂褐素?zé)晒庵递^CD組相比顯著降低(P＜0.05)。由此說(shuō)明，茶氨酸能夠有效降低氧化應(yīng)激損傷引起的線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素水平，減緩線蟲(chóng)機(jī)體的衰老。

圖4 L-茶氨酸對(duì)氧化應(yīng)激下線蟲(chóng)脂褐素含量的影響

2.6 L-茶氨酸對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化酶活力的影響

SOD 和CAT 是線蟲(chóng)體內(nèi)兩種重要的抗氧化酶[21]，GSH-Px 也具有抗氧化作用，是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶。L-茶氨酸不僅可以通過(guò)非酶促抗氧化，還能夠以SOD、GSHPx 抗氧化作為防線抑制過(guò)氧化物與過(guò)氧化氫等產(chǎn)生的雙重抗氧化作用[22]。由圖5 可知，給予一定劑量的茶氨酸后，秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化酶活力與對(duì)照組相比顯著升高，其中，與CD 組相比，LD、MD、HD 組線蟲(chóng)體內(nèi)的SOD 活力分別提升了56.8%(P＜0.001)、70.8%(P＜0.001)、80.4%(P＜0.001)，均達(dá)到極顯著差異水平；CAT 活力分別提升 了25.5%、52.9%(P＜0.05)、164.7%(P＜0.001)；GSH-PX 活力分別提升了7.2%、18.6%(P＜0.05)、51.0%(P＜0.001)。說(shuō)明L-茶氨酸能夠有效增強(qiáng)線蟲(chóng)的抗氧化性，這可能是其發(fā)揮抗衰老作用的機(jī)制之一。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)力測(cè)定、熱應(yīng)激下壽命和相對(duì)熒光檢測(cè)、氧化應(yīng)激下的壽命和脂褐素水平以及體內(nèi)抗氧化酶活力測(cè)定等方面結(jié)果表明，10μmol·L-1的L-茶氨酸能夠延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲(chóng)在熱應(yīng)激條件下的壽命以及在氧化應(yīng)激的條件下的最大壽命，極顯著地降低熱應(yīng)激后的相對(duì)熒光強(qiáng)度，提高它的抗脅迫能力。茶氨酸的合成還受到諸多生物和非生物因素的調(diào)控[23]，其啟動(dòng)子區(qū)含多個(gè)響應(yīng)逆境脅迫的順式作用元件，郭晨[24]等人也證明L-茶氨酸具有改善熱處理引起的小鼠組織損傷和氧化逆境的效果。L-茶氨酸可以降低氧化應(yīng)激后線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素水平，減緩衰老。同時(shí)10μmol·L-1劑量組氧化損傷線蟲(chóng)體內(nèi)SOD、CAT 和GSH-Px 活力極顯著增加(P＜0.001)。因此我們認(rèn)為這兩個(gè)方面可能與茶氨酸提高線蟲(chóng)的抗衰老能力有關(guān)。已有研究表明，L-茶氨酸可通過(guò)下調(diào)小鼠體內(nèi)炎癥因子的表達(dá),減少氧化應(yīng)激損傷，調(diào)控線粒體凋亡通路以減少細(xì)胞凋亡，抑制MAPK 信號(hào)通路降低促凋亡信號(hào)引起的凋亡[25-32]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為相關(guān)茶氨酸抗氧化保健產(chǎn)品開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，但本次研究只局限于生理表型方面，后期我們將通過(guò)基因表達(dá)檢測(cè)、組學(xué)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，系統(tǒng)探究其分子機(jī)制，為茶氨酸在食品工業(yè)或者制藥工程中的開(kāi)發(fā)提供理論幫助。