淋巴細胞主動免疫治療對反復種植失敗封閉抗體陰性患者助孕結局影響及相關因素分析

李栗妍, 馬向薇, 劉星池, 張 寧, 于月新

北部戰區總醫院 生殖醫學科,遼寧 沈陽 110016

反復種植失敗的原因很多,除了遺傳、內分泌、感染及解剖等以外,還有免疫因素。未知原因導致的流產大多與免疫因素密切相關,而其中具體機制仍無法確定[1]。隨著生殖免疫學研究的深入,人們對妊娠免疫、免疫性不孕及反復種植失敗等問題有了新的認識,已經逐漸確定了免疫因素在生殖過程中的重要作用[2]。有研究表明,復發性流產和不明原因性不孕癥可能與同種異體免疫調節機制的失衡、封閉抗體缺乏等相關[3-4],淋巴細胞主動免疫治療(lymphocyte immune therapy,LIT)可以提高封閉抗體陽性率,從而防止胚胎被母體免疫系統攻擊而流產[5]。LIT是將患者配偶或第三方無關人士的淋巴細胞注入患者皮下,刺激母體的免疫耐受機制,促進封閉抗體的產生,有效阻止胚胎父系抗原被母體免疫系統攻擊,保護胚胎[6],多次注射刺激還可以提高免疫記憶力,從而進一步提高再次妊娠成功的概率[7]。本研究旨在探討LIT對反復種植失敗的封閉抗體陰性患者助孕結局的影響,并分析其相關影響因素。現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取自2018年1月至2020年12月北部戰區總醫院收治的封閉抗體陰性且反復種植失敗的94例患者為研究對象。納入標準:封閉抗體檢測結果為陰性;無家族遺傳性疾病及近親婚史;患者及配偶染色體檢查結果正常;患者配偶精液檢查結果正常;符合《反復種植失敗臨床診治中國專家共識》中反復種植失敗的臨床診斷[8]。排除標準:合并輸卵管堵塞、子宮畸形等生殖系統器質性病變;合并生殖道感染;合并生殖系統惡性腫瘤;合并自身免疫性疾病;合并傳染性疾病,無法耐受LIT或不符合LIT指征。根據患者是否愿意接受LIT,將患者納入LIT組(n=58)和非LIT組(n=36)。患者及其家屬均簽署知情同意書。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 治療方法 根據準備行LIT的夫妻雙方的血常規、生化檢驗結果及家族遺傳性疾病史、近親婚史等判定是否可進行LIT。抽取供者30 ml全血,肝素鈉抗凝,用淋巴細胞分離液(天津灝洋華科生物科技有限公司)、0.9%氯化鈉溶液稀釋并充分混勻后,緩慢加入另一新的含10 ml淋巴細胞分離液的離心管中,以2 000 r/min離心20 min。充分離心后,管中由上而下分為4層:第1層為血漿,第2層環裝乳白色層為淋巴細胞層,第3層透明層為分離液層,第4層為紅細胞層。小心收集乳白色淋巴細胞層并以5 ml 0.9%氯化鈉溶液稀釋,以2 000 r/min離心15 min,將離心底部淋巴細胞團用1 ml 0.9%氯化鈉溶液渦旋混勻。取20 μl分離的淋巴細胞混懸液進行計數,處理后的淋巴細胞濃度應調整至20×106～40×106個/L,總體積為1 ml。將淋巴細胞混懸液在患者雙側前臂皮內進行多點注射,每次每點為0.3～0.5 ml。經3次LIT后,于末次治療后7～10 d檢查封閉抗體是否轉陽。若沒有產生封閉抗體,從第4次治療開始,每次治療后7～10 d檢測封閉抗體,直到轉為陽性。在實驗取得陽性結果后,根據臨床情況進行輔助生殖,并每2～3個月進行1次后續LIT,確定妊娠后至12周超聲顯示胎盤發育良好后可結束治療。非LIT組患者直接根據自身情況選擇合適的輔助生殖策略進行助孕。

1.3 觀察指標 記錄LIT組的治療次數、封閉抗體陽性率及LIT治療濃度,封閉抗體采用美國望嵐達公司生產的人類白細胞抗原特異性IgG抗體檢測試劑盒檢測。比較LIT組和非LIT組的臨床指標,包括:年齡、配偶年齡、體質量指數、流產次數、不孕時間,治療前的雙側竇卵泡數和卵泡刺激素、促黃體生成素、泌乳素、雌二醇、睪酮、孕酮、抗繆勒氏管激素水平,以及輔助生殖成功率。輔助生殖成功判定:移植后14 d檢查血清人絨毛膜促性腺激素符合妊娠水平、21 d超聲檢查觀察無異位妊娠的可能、28 d超聲觀察存在胎心胎芽則判定為輔助生殖成功。同時,分析各臨床指標與反復種植失敗的封閉抗體陰性患者助孕結局的相關性、反復種植失敗的封閉抗體陰性患者助孕成功的影響因素。

2 結果

2.1 LIT組治療情況 58例患者中:11例(18.97%)治療4次后實現封閉抗體轉陽,接受LIT的治療濃度為30×106個/ml;47例(81.03%)治療5次后實現封閉抗體轉陽,其中,28例(48.27%)接受LIT的治療濃度為25×106個/ml,19例(32.76%)接受LIT的治療濃度為22×106個/ml。

2.2 兩組臨床指標比較 兩組平均年齡、配偶年齡、體質量指數、流產次數、不孕時間,治療前的雙側竇卵泡數和卵泡刺激素、促黃體生成素、泌乳素、雌二醇、睪酮、孕酮、抗繆勒氏管激素水平比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。LIT組輔助生殖成功率高于非LIT組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組臨床指標比較

2.3 各臨床指標與反復種植失敗的封閉抗體陰性患者助孕結局的相關性分析 年齡、配偶年齡、體質量指數、流產次數、不孕時間、卵泡刺激素、促黃體生成素、泌乳素、雌二醇、睪酮、孕酮、抗繆勒氏管激素、左側竇卵泡數、右側竇卵泡數與反復種植失敗的封閉抗體陰性患者助孕結局無明顯相關性(r=-0.071、-0.051、0.084、-0.031、-0.017、-0.020、-0.099、0.026、-0.004、-0.028、0.049、-0.037、-0.062、-0.113,P均>0.05)。LIT與反復種植失敗的封閉抗體陰性患者助孕結局存在相關性(r=0.225,P<0.05)。

2.4 反復種植失敗的封閉抗體陰性患者助孕成功的影響因素分析 接受LIT是反復種植失敗的封閉抗體陰性患者助孕成功的影響因素(P<0.05)。見表2。

表2 反復種植失敗的封閉抗體陰性患者助孕成功的影響因素分析

3 討論

在臨床醫學實踐中,反復種植失敗一直都是患者和醫師共同面對的難題。胚胎著床的過程十分復雜,很容易受到多種因素的影響,在胚胎移植前的任何一個環節出現問題都可能導致著床障礙[9]。盡管尚不清楚其具體的病因及機制,但是已經有研究證實了反復種植失敗與包括子宮內膜容受性降低、胚胎質量、胚胎移植技巧缺陷、精神心理因素等多種因素有關[10]。優質的胚胎和良好的子宮環境是成功種植的關鍵,但是值得注意的是,在體外受精-胚胎移植過程中,雖然有些患者擁有優質的胚胎和正常的子宮內膜形態,但是多次移植仍然未能成功妊娠[11]。對于這些反復種植失敗的患者,如果排除了染色體異常、解剖結構異常、內分泌失調、生殖道感染、自身免疫疾病等病因,還需要考慮免疫平衡是否遭到了破壞,導致免疫耐受下降,繼而影響胚胎的存活[12]。體外受精-胚胎移植治療周期中,為了募集更多卵泡而使用的外源性促性腺激素會產生高水平的雌二醇,從而導致患者處于性激素高生理水平狀態,免疫微環境也會相應發生變化[13]。有研究發現,在雌二醇的超生理水平影響下,內膜和外周血淋巴細胞總數量,特別是自然殺傷細胞的數量會增加,這可能與反復種植失敗的發生有關[14]。

隨著生殖免疫學的進展,越來越多的研究發現反復種植失敗與母胎免疫調節紊亂密切相關[15]。當胚胎攜帶父系抗原種植在母體內時,相當于進行了一次半同種異體移植,母體會將來自父親的基因抗原視為外來異物而進行排斥,因此,胚胎會在母體內被免疫清除。如果母體的免疫系統與胚胎源性抗原形成了免疫平衡狀態,那么胚胎就可以得以存活;而一旦這種免疫平衡狀態被破壞了,就會導致母胎免疫失衡,從而可能導致反復胚胎種植失敗或流產的發生[16]。在這個過程中,免疫學調控起著重要的作用。在正常的妊娠中,人類白細胞抗原被互相排斥,胚胎所攜帶的父源性人類白細胞抗原就可以刺激母體免疫系統,從而產生IgG型封閉抗體。這個抗體不僅可以與母體淋巴細胞表面抗原結合,還可以與胚胎自身的滋養細胞結合,從而阻斷母體對胎兒的免疫識別和免疫反應[17]。目前,臨床可以應用LIT技術對缺乏封閉抗體的反復種植失敗患者進行免疫治療,主要是通過引入患者配偶(或第三方)的淋巴細胞來刺激患者的免疫系統,從而產生具有免疫保護作用的封閉抗體[18]。當患者再次妊娠時,這些封閉抗體就可以識別胚胎上來自丈夫的抗原,并與之結合,從而產生封閉作用,防止胚胎或胎兒父系抗原被母體免疫系統識別和殺傷,從而讓胚胎得到保護并且進行生長發育。本研究結果顯示:LIT組輔助生殖成功率高于非LIT組,差異有統計學意義(P<0.05);接受LIT是反復種植失敗的封閉抗體陰性患者助孕成功的影響因素(P<0.05)。LIT用于不明原因復發性流產患者時,主要機制是淋巴細胞免疫可提高患者的免疫反應性,從而使其獲得封閉抗體,同時也可提高患者外周血CD4+CD25+調節性T細胞的數量,并且誘導患者體內Th1/Th2平衡向Th2偏離,從而防止胚胎或胎兒父系抗原被母體免疫系統識別和殺傷,產生免疫保護,從而幫助維持正常妊娠[19-21]。

綜上所述,反復種植失敗的封閉抗體陰性患者接受LIT可有效使封閉抗體轉陽,提高輔助生殖的助孕效果。