肝細胞癌中miR-219表達對肝細胞癌干細胞特性的影響及作用機制

楊江華 周玥 程亞男 趙彬 張秋麗 陳欣菊

(1濮陽市人民醫院消化內科,河南 濮陽 457000;2河南中醫藥大學第一附屬醫院)

肝細胞癌(HCC)是原發性肝癌中最常見的類型,在癌癥相關死亡率中位列前3〔1〕。大多數HCC患者診斷時已處于晚期階段,且放射治療、靶向治療和免疫治療效果不容樂觀〔2〕。HCC中有一小部分細胞稱為肝癌干細胞(CSCs),肝CSCs具有自我更新能力、致瘤能力強,對化療抵抗和易復發等特征〔3,4〕。有研究顯示,HCC的化學耐藥性和復發與肝CSCs的存在密切相關〔5,6〕。因此,了解肝CSCs的調控機制有望成為治療HCC有效策略。miRNA本質是小的非編碼RNA,通過與非翻譯區域中的結合位點結合調節靶蛋白水平,從而導致信使RNA降解和(或)停止翻譯,可參與癌基因或抑癌基因的啟動,影響腫瘤進展和轉移〔7〕。miRNA還參與調節肝CSCs的自我更新、致瘤能力和化療耐藥性〔8～10〕。研究表明,微小RNA(miR)-219過表達可促進多能干細胞向少突膠質前體細胞的分化,恢復神經退行性疾病和脫髓鞘疾病中失去功能的細胞,為神經退行性疾病的細胞治療提供可能〔11〕。然而miR-219在HCC中是否對肝CSCs亦有調節作用,目前研究還較少,本文通過檢測miR-219在HCC組織和細胞中的表達水平,降低其表達水平后研究對肝CSCs的影響。

1 材料與方法

1.1材料 2021年5月至2022年1月在濮陽市人民醫院行手術切除的HCC患者20例,術前未接受任何治療,未合并其他腫瘤。收集HCC組織和對應的癌旁組織,置于-80 ℃冰箱中保存待用。肝癌細胞(Huh-7、SMMC-7721和HepG2)及正常人肝細胞(L02)均購于中國科學院上海細胞庫。RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司,聚合酶鏈反應(PCR)檢測試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。CD133、EpCAM抗體購于美國abcam公司,si-NC和si-miR-129質粒由上海吉凱基因公司合成。

1.2qRT-PCR檢測miR-219表達水平 收集HCC組織、癌旁組織、Huh-7、SMMC-7721、HepG2及L02細胞,利用Trizol提取組織和細胞中的總RNA,并逆轉為cDNA,以U6為內參,進行熒光定量PCR。引物序列:U6正向5′-GATTCAGCACCACTTATCC TAAAAT-3′,反向5′-CGCTACACGTATTCGAGTAACAT-3′。miR-219正向5′-CCGTCAACAGCGCGCGTGT-CTC-3′,反向5′-CACTGTCCTCATGGGTCTCGC-3′。獲取目的基因和內參基因的Ct,以2-△△Ct法分析各實驗數據。

1.3轉染實驗敲低HepG2細胞中miR-219表達 收集對數生長期的HepG2細胞,接種于6孔板中,采用無血清培養基孵育24 h。按脂質體Lipofectamine2000說明書,將si-NC和si-miR-219質粒轉染至HepG2細胞中,設為si-NC組和si-miR-219組,同時設置Control組(未轉染質粒),放置恒溫箱中培養6 h。更換含有10%胎牛血清的培養基,繼續孵育12 h,收集細胞利用qRT-PCR檢測si-NC組、si-miR-219組和Control組中miR-219表達水平。

1.4流式細胞術檢測CD133+、EpCAM+細胞比例 收集Control組和經轉染處理后si-NC組和si-miR-219組細胞,以1 000 r/min離心5 min,留取細胞沉淀,加入3 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,以1 000 r/min離心5 min收集細胞沉淀。分別加入CD133抗體和EpCAM抗體,總體積為100 μl(抗體:PBS為1∶50),輕輕混勻,在4 ℃冰箱中放置30 min,每隔10 min,輕彈混勻,采用流式細胞儀檢測CD133+、EpCAM+細胞比例。

1.5懸浮腫瘤球形成實驗檢測腫瘤細胞干性 收集Control組和經轉染處理后si-NC組和si-miR-219組細胞,以500個細胞的密度分別接種于96孔板中,每組設置6個平行孔,放置恒溫箱中培養。根據培養液中PH值變化情況更換培養基,3～4 d更換1次,從培養的第3天起,每天定時觀察細胞生長情況,培養3 w,腫瘤球生長較大,在顯微鏡下拍照。每組抽取5個視野,計算腫瘤球形成的數目。

1.6qRT-PCR檢測KLF4、SOX2、OCT4、Bmi-1和Nanog mRNA水平 具體方法見1.2,引物序列:KLF4正向引物5′-GGCTGTTGGGAGCACATGCCTC-3′,反向5′-TTCAAGACATGCTCTAGTATCAT-3′;SOX2正向引物5′-ATCGTAACTGGGTCACTGCTCA-3′,反向5′-GACCGTTACGGGCCTGAAACG-3′;OCT4正向引物5′-ACTGGTAACGGTTAGCTAGCTA-3′,反向5′-GCTGGTACGTCCGTAGATGCAT-3′;Bmi-1正向引物5′-CTAAGTCGTGACTGTGACGTGC-3′,反向5′-CTCCAAGTCCTGATGACTGATC-3′;Nanog正向引物5′-AATGCTGATCTGCTAGCTCGTAC-3′,反向5′-CGTA-GTCGATCGACTGACTGAT-3′。

1.7統計學分析 應用SPSS21.0軟件行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1miR-219在HCC組織和細胞中表達比較 20例HCC腫瘤組織中miR-219相對表達水平(2.8±0.6)顯著高于癌旁組織(1.0±0.3;t=4.021,P<0.05)。Huh-7(2.6±0.6)、SMMC-7721(2.9±0.8)和HepG2(4.1±0.7)細胞中miR-219相對表達水平顯著高于L02細胞(1.0±0.3;t=4.526、4.824、6.325,均P<0.05),見表1。

表1 20例HCC腫瘤和癌旁組織中miR-219相對表達水平(n=3)

2.2敲低HepG2細胞中miR-219表達對CD133+和EpCAM+細胞比例的影響 si-NC、si-miR-219質粒分別轉染至HepG2細胞后,qRT-PCR結果顯示:si-miR-219組miR-219相對表達水平(1.10±0.21)顯著低于Control組和si-NC組(4.01±0.57、4.12±0.70;t=9.443、9.822,均P<0.01)。si-miR-219組CD133+細胞比例〔(13.07±2.32)%〕顯著低于Control組和 si-NC組〔(26.67±5.11)%、(24.63±3.60)%;t=6.120、5.204,均P<0.05〕。si-miR-219組EpCAM+細胞比例〔(2.27±1.16)%〕顯著低于Control組和si-NC組〔(10.47±2.40)%、(9.63±1.60)%;t=7.907、7.103,均P<0.01〕,見圖1。

圖1 敲低HepG2細胞中miR-219表達可減弱干細胞特性

2.3敲低HepG2細胞中miR-219表達對細胞懸浮腫瘤球形成的影響 si-miR-219組細胞懸浮腫瘤球形成數量〔(15.00±1.00)個〕顯著低于Control組和si-NC組〔(21.67±2.08)個、(22.00±3.61)個;t=4.671、4.905,均P<0.05〕,見圖2。

2.4敲低HepG2細胞中miR-219表達對干細胞特性相關因子表達的影響 與Control組、 si-NC組相比,si-miR-219組c-Myc、SOX2、OCT4、Bmi-1和NanogmRNA水平顯著降低(均P<0.05),見表2。

圖2 敲低HepG2細胞中miR-219表達可抑制細胞懸浮腫瘤球的形成(×200)

表2 各組c-Myc、SOX2、OCT4、Bmi-1和Nanog mRNA水平比較

3 討 論

HCC是常見的惡性腫瘤,術后轉移和復發仍然是患者預后不良的主要原因。經導管動脈化療栓塞和索拉非尼是治療晚期肝癌患者的治療方案,但臨床效果并不理想。肝CSCs具有自我更新和異質性特點,在體外可促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲并促進體內成瘤性,被認為是腫瘤復發和轉移的始祖細胞〔12〕。

目前已有研究顯示,肝CSCs可促進腫瘤的惡性行為〔13〕。因此抑制肝CSCs有望成為治療腫瘤的新途徑,可降低HCC患者的復發轉移并有效改善患者預后。越來越多的證據表明,miRNA表達與許多人類腫瘤的生物學功能密切相關。有研究顯示,miR-219-5p在惡性骨腫瘤脊索瘤中可抑制腫瘤細胞的增殖和克隆形成,并與腫瘤復發相關〔14〕。Hudish等〔15〕研究顯示,敲低miR-219表達可促進原發性纖毛的生長,影響分化的神經上皮祖細胞向分化的神經元和神經膠質的轉變。

miR-219在肝CSCs中的作用目前還未明確,本研究首先檢測到HCC組織和細胞中miR-219表達水平增加,提示miR-219在HCC中發揮促癌基因的作用。CD133和EpCAM是肝CSCs表面常見的腫瘤標記物,可用于CSCs細胞的篩選和鑒定。既往有研究顯示,CD133調節肝CSCs的自我更新、增殖、遷移和上皮間質轉化,并與腫瘤耐藥和瘤體血管的形成有一定關系〔16〕。EpCAM參與腫瘤細胞的增殖和侵襲,EpCAM+的HCC細胞具有更強的侵襲性和成瘤性〔17〕。本文結果表明,降低miR-219表達水平可抑制HepG2細胞的干細胞特性。c-Myc、SOX2、OCT4、Bmi-1和Nanog等轉錄因子在CSCs維持自我更新能力和異質性中必不可少〔18〕。Yong等〔19〕研究顯示,上調Nanog和Oct4水平可促進人胃癌干細胞樣特性。Bahr等〔20〕研究顯示,與原始細胞相比,控制小鼠造血干細胞和祖細胞中Myc表達可增加人類急性髓細胞白血病干細胞染色質的可及性。Hagey等〔21〕證明SOX2可調節細胞類型特異性及神經和內胚層干細胞中的核心轉錄程序。Wang等〔22〕研究顯示Bmi-1可通過上調miR-21的表達正向調節干細胞樣特性。

綜上,miR-219在HCC中表達水平增加,降低其表達水平后可通過下調c-Myc、SOX2、OCT4、Bmi-1和Nanog水平,抑制HepG2細胞的干性特征。miR-219有可能成為治療HCC的潛在靶向分子,為HCC的干預和預防提供新思路。