基于離子交換色譜法同時測定果酒中8種有機酸

徐玲萍，張芳芳，羅振玲，夏慧麗*

（臺州市食品檢驗檢測中心，浙江 臺州 318000）

所謂“無酸不成酒”，酸具有呈味作用，適量的酸可使酒口感活潑、爽口、協調[1]。水果本身含有大量的有機酸，果酒在發酵過程中也會產生不同種類的酸[2-4]。這些酸的組成和含量有別于白酒、黃酒，使果酒具備其獨特風味。酸含量過低，酒味寡淡、單調；酸含量過高，酒味粗澀、不協調。曾竟藍等[5]介紹了常見果酒中主要有機酸的種類和含量，并綜述了有機酸對果酒口感、風味、穩定性等方面的影響。劉淑珍等[6]研究發現，采用D314弱堿性樹脂進行降酸處理獼猴桃酒能更好地保存獼猴桃的特征香氣成分，感官品質更好。衛春會等[7]以山葡萄酒為研究對象，發現發酵過程中不同的有機酸呈現出不同的變化規律，并闡明有機酸對山葡萄酒的色澤、口感、品質及生物穩定性方面的重要影響。因此，研究果酒中有機酸的組成和含量，用于解析果酒風味形成、控制果酒的品質具有重要意義。

目前，有機酸的檢測方法主要有氣相色譜（gas chromatography，GC）法[8]、氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）法[9]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[10-13]、液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[14]和離子色譜（ion chromatography，IC）法[15-16]。GC及GC-MS法主要用于測定易揮發的小分子有機酸，對于大分子有機酸需要衍生化處理，重現性差[17]。HPLC及LC-MS/MS法受到樣品基質干擾，需要更為復雜的前處理過程，并且往往使用極性大的流動相，對色譜柱破壞性大[18]。離子色譜法因其靈敏度高、對物質有特異性選擇、環境友好等優點，逐漸成為選擇的重點[19]。離子色譜主要包括離子交換色譜、離子排斥色譜和離子對色譜三種，其中應用最廣泛的是離子交換色譜。離子交換色譜是利用離子交換的原理對共存的多種陰離子或陽離子進行分離檢測。近幾年應用離子色譜法開展有機酸測定的研究越來越廣泛[20-22]，但相關研究很少涉及解決蘋果酸和琥珀酸兩個主要成分分離困難問題，也鮮有發現用離子色譜法同時測定果酒樣品中有機酸組分的研究。

本研究以葡萄酒為基質，采用電導抑制器離子色譜法，考察樣品前處理、色譜柱、梯度洗脫程序等多方面的影響因素，建立同時測定果酒中8種有機酸的離子交換色譜法，為研究果酒中有機酸的組成和變化規律提供有力的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

D-（-）-奎寧酸、乙酸、甲酸、乳酸、檸檬酸、DL-蘋果酸、琥珀酸、DL-酒石酸標準品（純度≥90%）：上海安譜璀世標準技術服務公司；IC-Guard RP凈化小柱（1 mL）：上海安譜實驗科技股份有限公司；楊梅酒、葡萄酒、桑葚酒、荔枝酒、藍莓酒：市售。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Dionex-ICS6000離子色譜儀、Dionex IonPac AS11-HC色譜柱、Dionex IonPac AS19色譜柱、Dionex IonPac AG19色譜柱：美國ThermoFisher公司；MS204S電子天平：梅特勒-托利多公司；Milli-Q超純水儀：美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的制備

準確稱取D-（-）-奎寧酸、乳酸、甲酸、乙酸、檸檬酸、DL-蘋果酸、琥珀酸、DL-酒石酸標準品各100 mg，用超純水溶解并定容至100 mL，配制成質量濃度均為1 000 mg/L的標準儲備溶液。分別取1 mL標準儲備溶液于同一容量瓶，超純水定容至50 mL，配制成各組分質量濃度均為20 mg/L的混合標準中間溶液。取混合標準中間溶液，用超純水配制成質量濃度為0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L的系列標準工作液。

1.3.2 樣品前處理方法的選擇

取葡萄酒樣品1 mL，用超純水稀釋并定容至100 mL，記為樣品A，即為直接稀釋的前處理方法。取樣品A通過RP凈化小柱（經5 mL甲醇和15 mL超純水活化），棄去前面3 mL流出液，收集后面流出液，記為樣品B，即為稀釋樣品再經RP凈化小柱凈化的前處理方法。樣品經0.22 μm水系濾膜過濾后，觀察樣品外觀，并進行離子交換色譜分析，考察2種前處理方式對樣品雜質的凈化效果及目標物的保留能力。

1.3.3 儀器條件

分離色譜柱：Dionex IonPac AS19（4 mm×250 mm）；保護柱：Dionex IonPac AG19（4 mm×50 mm）；進樣量：50 μL；流動相：KOH溶液（由Dionex EGC500 KOH淋洗液自動發生器在線產生）；流速：1.0 mL/min；檢測器：電導檢測器；池溫：30 ℃；柱溫：30 ℃；抑制器：Dionex ADRS 600 4 mm；抑制電壓：3.7 V；梯度洗脫條件：0～13 min，4 mmol/L KOH溶液；13～14 min，4～16 mmol/L KOH溶液；14～33 min，16 mmol/L KOH溶液；33～37 min，16～50 mmol/L KOH溶液；37～43 min，50 mmol/L KOH溶液；43～45 min，50～4mmol/LKOH溶液；45～50min，4mmol/LKOH溶液。

1.3.4 儀器條件選擇

色譜柱選擇：分別采用Dionex IonPac AS11-HC和Dionex IonPac AS 19兩種陰離子交換柱對質量濃度為10 mg/L的8種有機酸混合標準溶液進行測定，考察不同的色譜柱對目標化合物的分離效果。

淋洗液濃度選擇：調整氫氧化鉀淋洗液濃度，對質量濃度為10 mg/L的8種有機酸混合標準溶液進行測定。考察不同濃度（2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L）的氫氧化鉀淋洗液對奎寧酸、乳酸、乙酸、甲酸的分離效果，不同濃度（10 mmol/L、13 mmol/L、16 mmol/L、19 mmol/L）的氫氧化鉀淋洗液對蘋果酸、酒石酸、琥珀酸的分離效果。

流動相流速選擇：設置不同流動相流速（0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min），從柱壓和柱效方面考察方法的適宜性。

1.3.5 方法學考察

線性關系：采用最優的檢測方法對不同質量濃度的有機酸系列標準工作液進行測定，以有機酸質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，繪制有機酸標準曲線，并計算標準曲線的回歸方程和相關系數（R2）。

精密度試驗：選擇質量濃度為10 mg/L的8種有機酸混合標準溶液進行6次重復進樣，記錄目標化合物保留時間和峰面積，計算保留時間相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）和峰面積RSD。

穩定性試驗：選擇質量濃度為10 mg/L的8種有機酸混合標準溶液分別在0 h、2 h、4 h、8 h、10 h、12 h、24 h進樣測定，記錄目標化合物峰面積，并計算峰面積RSD。

檢出限、定量限試驗：選擇質量濃度為20 mg/L的8種有機酸混合標準溶液，采用最優的檢測方法進行檢測，以3倍的信噪比確定方法檢出限（limit of detection，LOD），以10倍的信噪比確定方法定量限（limit of quantitatively，LOQ）。

加標回收率試驗：取葡萄酒樣品，結合本底值添加一定質量濃度的標準品，奎寧酸、乙酸、甲酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸為250 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L三個水平加標量，乳酸為1 000 mg/L、2 000 mg/L、4 000 mg/L三個水平加標量，酒石酸為500 mg/L、1 000 mg/L、2 000 mg/L三個水平加標量。平行測定三次，計算目標化合物的回收率及RSD。

1.3.6 數據處理

采用Chromeleon 7.2.7軟件進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件優化

發酵型果酒因未經蒸餾處理，含有色素、氨基酸、糖類、酯類等豐富的有機物[23-24]，這些有機物會影響色譜柱的分離效果，縮短色譜柱的使用壽命。本研究以葡萄酒為基質，對直接稀釋（A）和稀釋后經RP柱凈化（B）的兩種前處理方法進行比較。從外觀上比較，樣品A呈紅色有顆粒物，樣品B無色澄清。采用離子交換色譜對兩個樣品進行檢測，結果見圖1。由圖1可知，相較于樣品A，樣品B圖譜基線平穩，雜質峰少。因此，為保護色譜柱，減少雜質干擾，最終選擇稀釋后經RP凈化柱凈化的前處理方式。

圖1 葡萄酒樣品經不同前處理方法離子交換色譜圖Fig.1 Ion exchange chromatograms of wine samples with different pretreatment methods

2.2 儀器條件優化

2.2.1 色譜柱的選擇

分別采用Dionex IonPac AS11-HC和Dionex IonPac AS19兩種常用陰離子交換柱對質量濃度為10 mg/L的標準工作液進行測定，結果見圖2。

圖2 10 mg/L標準工作液經Dionex IonPac AS11-HC（A）和Dionex IonPac AS19（B）色譜柱分離后的離子交換色譜圖Fig.2 Ion exchange chromatogram of 10 mg/L standard working solution separated by Dionex IonPac AS11-HC (A) and Dionex IonPac AS19 (B) columns

由圖2可知，兩種色譜柱對有機酸的分離效果存在顯著的差異。Dionex IonPac AS11-HC色譜柱無法很好地將琥珀酸和蘋果酸分開，而Dionex IonPac AS19色譜柱能將8種有機酸有效分離，其中酒石酸和琥珀酸分離度稍差，其余組份的分離度均＞1.4，分析原因可能是Dionex IonPac AS19色譜柱的固定相填料主要為超孔型EVB-DVB顆粒，本身帶有正電荷，具有高容量、強親水的特點，適用于各類復雜樣品基體中的陰離子測定。因此，最終選用Dionex IonPac AS19色譜柱。

2.2.2 淋洗液濃度優化

因奎寧酸、乳酸、乙酸、甲酸待測組分與固定相親和力較弱，最早被洗脫出來。選取不同濃度（2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L）的氫氧化鉀溶液作為初始淋洗液，考察其對這4種有機酸的分離效果，結果見圖3。由圖3可知，氫氧化鉀淋洗液濃度越高，洗脫能力越強，分離效果越差。當6 mmol/L氫氧化鉀作為淋洗液時，奎寧酸、乳酸和乙酸分離效果不理想；當2 mmol/L和4 mmol/L氫氧化鉀作為淋洗液時，目標化合物均能實現很好的分離，其中4 mmol/L氫氧化鉀作為淋洗液時，總用時少，信號響應高，檢測效率和靈敏度更優。故選用4 mmol/L氫氧化鉀作為0～13 min的淋洗濃度。

圖3 不同濃度氫氧化鉀淋洗液分離奎寧酸、乳酸、乙酸及甲酸的離子交換色譜圖Fig.3 Ion exchange chromatogram of quinic acid, lactate, acetate and formic acid separated at different concentrations of potassium hydroxide

蘋果酸（2-羥基丁二酸）、酒石酸（2,3-二羥基丁二酸）、琥珀酸（丁二酸）的結構和性質比較相似，目標物出峰時間較為集中，分離難度大。因此，以10 mmol/L、13 mmol/L、16 mmol/L、19 mmol/L的氫氧化鉀作為淋洗液，考察其分離效果，結果見圖4。

圖4 不同濃度氫氧化鉀淋洗液分離蘋果酸、酒石酸及琥珀酸的離子交換色譜圖Fig.4 Ion exchange chromatogram of malate,tartaric acid and succinate separated at different concentrations of potassium hydroxide

由圖4可知，10 mmol/L、13 mmol/L氫氧化鉀作為淋洗液時，峰有拖尾現象，且檢測時間較長；當選用19 mmol/L氫氧化鉀作為淋洗液時，蘋果酸、酒石酸和琥珀酸分離效果略差，影響其定量的準確性。綜合比較，16 mmol/L氫氧化鉀作為淋洗液時，蘋果酸、酒石酸和琥珀酸的分離效果均較佳，因此，確定16 mmol/L氫氧化鉀作為14～33 min的淋洗濃度。

2.2.3 流速優化

流動相流速對保留時間和系統壓力都有很大的影響，因此考察不同流速（0.8 mL/min、1.0 mL/min和1.2 mL/min）對系統壓力、峰形、出峰時間方面的影響，結果見圖5。由圖5可知，流速為1.2 mL/min時，柱壓接近3 000 psi，目標峰尖銳對稱；流速為1.0 mL/min時，柱壓接近2 000 psi，目標峰略有變寬；流速為0.8 mL/L柱效較前兩者有明顯的降低，目標峰延后明顯，因此，最終確定流速為1.0 mL/min。

圖5 不同淋洗液流速下10 mg/L標準工作液的離子交換色譜圖Fig.5 Ion exchange chromatogram of 10 mg/L standard working solution at different eluent flow rates

2.3 方法學考察結果

2.3.1 線性范圍、檢出限、定量限、精密度及穩定性試驗

對8種有機酸的相關系數、檢出限、定量限、精密度和穩定性進行測試，結果見表1。由表1可知，8種有機酸標準曲線的相關系數R2為0.996 5～0.998 7，說明各組份含量與峰面積呈良好線性關系，該方法可對相關物質進行準確定量分析。8種有機酸的檢出限（LOD）為0.82～4.05 mg/L，定量限（LOQ）為2.74～13.5 mg/L，保留時間精密度試驗結果的RSD≤0.07%，峰面積精密度試驗結果的RSD≤1.90%，方法穩定性試驗結果的RSD≤3.65%，各參數符合方法學要求，能滿足8種有機酸定性和定量分析的要求。

表1 8種有機酸的線性相關系數、檢出限、定量限、精密度和穩定性結果Table 1 Correlation coefficients, limit of detection, limit of quantification, precision and stability results of the 8 organic acids

2.3.2 加標回收率試驗

葡萄酒樣品添加不同質量濃度標準物質的加標回收率試驗結果見表2。由表2可知，8種有機酸的加標回收率在82%～125%之間，加標回收率試驗結果的RSD為0.21%～5.13%，表明該方法具有較高的準確度。

表2 葡萄酒樣品8種有機酸含量測定加標回收試驗結果Table 2 Results of 8 organic acid content determination and standard recovery rate tests of wine samples

2.4 不同基質樣品8種有機酸含量的測定

有機酸的組成和占比構建出不同果酒特有的味道，也是果酒功效性成分的重要來源之一[25-27]。為考察不同果酒中主要有機酸的組成和含量，運用建立的檢測方法，對在市面上隨機采集的葡萄酒、桑葚酒、藍莓酒、楊梅酒和荔枝酒等不同基質果酒樣品中的8種有機酸成分及含量進行測定，結果見表3。

表3 5種果酒樣品中8種有機酸含量的測定結果Table 3 Determination results of 8 organic acids in 5 fruit wine samples

由表3可知，葡萄酒主要有機酸成分是乳酸、酒石酸、琥珀酸和乙酸，這4種有機酸的總含量為5 498.50 mg/L，占總有機酸含量的99.7%，為葡萄酒主要呈味物質。桑葚酒、藍莓酒、楊梅酒、荔枝酒的主要有機酸均為檸檬酸，其含量在2 888.65～5 730.89 mg/L之間，占比均＞50%。此外，桑葚酒和藍莓酒含有豐富的酒石酸，含量分別為424.26 mg/L和772.39 mg/L。楊梅酒含有乙酸和琥珀酸，含量分別為1 185.15 mg/L和575.37 mg/L，是其獨特的果酸味重要來源。荔枝酒相對于其他果酒蘋果酸含量更高，為522.26 mg/L。

3 結論

本研究通過優化樣品前處理和儀器條件建立了同時測定發酵型果酒中8種有機酸含量的離子交換色譜法，即樣品經稀釋和RP柱凈化后，經Dionex IonPac AS19色譜柱（4 mm×250 mm）分離，0～13 min 4 mmol/L和4～33 min 16 mmol/L氫氧化鉀梯度淋洗，采用抑制型電導檢測器進行檢測。8種有機酸標準曲線的相關系數R2在0.996 5～0.998 7之間，檢出限為0.82～4.05 mg/L，定量限為2.74～13.5 mg/L，精密度試驗結果的相對標準偏差（RSD）均＜3%，穩定性試驗結果的RSD≤3.65%，加標回收率為82%～125%，加標回收率試驗結果的RSD為0.21%～5.13%。該方法操作簡便、性能穩定、安全環保，適用于各類果酒的測定。采用該方法對5類市售果酒樣品中的8種有機酸進行檢測，發現葡萄酒主要有機酸成分為乳酸、酒石酸、琥珀酸和乙酸，這4種有機酸的總含量為5 498.50 mg/L；桑葚酒、藍莓酒、楊梅酒、荔枝酒的主要有機酸均為檸檬酸，其含量在2 888.65～5 730.89 mg/L之間。