基于GC-IMS不同年份黃酒揮發性風味物質分析

沈 棚，薛紅瑋

（1.上海康諾執信食品有限公司，上海 201703；2.上海營家生物科技有限公司，上海 201703）

黃酒與啤酒、葡萄酒并稱世界三大古酒，以玉米、稻米、小麥、黍米等為原料，經過蒸料，拌以米曲、酒藥或麥曲，進行糖化和發酵制成[1]。黃酒通常具有色、香、味、格的復雜特征[2]。由于發酵原料[3]、釀造工藝[4]、發酵微生物[5]、貯藏環境[6]以及陳釀時間[7]的不同，黃酒中所形成的風味物質也不盡相同。其中，陳釀是黃酒生產工藝中較為重要的一個環節，陳釀時間也可稱為酒齡，是評價黃酒質量的重要指標。黃酒在陳釀過程中會發生大量的物理和化學變化，這些變化對于酒體協調性和穩定性起著關鍵性作用。目前，針對不同陳釀時間黃酒風味物質的相關研究已逐步展開[8]，利用現代儀器分析技術分析黃酒中的揮發性物質的種類及其含量，有助于了解不同陳釀時間黃酒的香氣組成成分及其風味特征[9]。

氣相色譜-離子遷移色譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）法是一種快速檢測分析待測樣品中揮發性物質的技術[10]。該技術無需樣品前處理，極大簡化了分析過程，可實現快速檢測，且其靈敏度更高，檢測限更低[11]。近年來被廣泛應用于分析酒類、茶葉、香精香料、肉制品、中藥等樣品中揮發性風味物質[12]。鮮靈芝等[13]使用氣相色譜-離子遷移譜（GC-IMS）比較新品糯米楊梅酒與楊梅酒的揮發性物質，結果表明，兩種樣品組成成分有顯著差異，其中，糯米楊梅酒的揮發性物質種類更為豐富；顧雙等[14]采用GC-IMS技術建立了一種黃酒標注酒齡及品牌快速鑒別的方法，結果表明，GC-IMS技術在黃酒質量評估等領域有較好的應用前景。雖然GC-IMS技術已廣泛運用于食品風味檢測，但關于GC-IMS技術分析不同貯藏年份黃酒揮發性風味物質方面的研究鮮有報道。

本研究采用GC-IMS技術對不同年份黃酒中的揮發性風味物質進行分析，構建指紋圖譜，并進行主成分分析（principal component analysis，PCA）及聚類分析（cluster analysis，CA），以期為黃酒中揮發性風味物質的鑒別提供科學依據，為不同陳釀年份黃酒的揮發性風味物質研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

分別選取2008、2010、2012、2014、2018、2019年份采用相同工藝分別制作的6個黃酒樣品，分別編號為A08、A10、A12、A14、A18、A19：產地為紹興。

2-辛醇（分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

FlavourSpec氣相色譜離子遷移譜儀：德國GAS公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

稱1mL樣品置于20mL頂空瓶，將5μL2-辛醇（500mg/L）作為內標物質加入樣品中。在常溫下經頂空進樣，并采用氣相色譜-離子遷移譜儀進行測定，每個樣品重復測定3次。

1.3.2 GC-IMS分析

進樣條件：采用自動頂空進樣，進樣體積200 μL，孵育時間15 min，孵育溫度60 ℃，進樣針溫度85 ℃，孵化轉速500 r/min。

GC條件：MXT-WAX色譜柱（30 m×0.53 mm，1 μm），分析時間40 min，柱溫60 ℃，載氣/漂移氣為高純氮氣（N2），載氣/漂移氣條件：初始流速為2 mL/min，維持2 min；8 min內升至10 mL/min，在10 min內升至100 mL/min，維持20 min，總GC運行時長為40 min。

IMS條件：漂移管長度5.3 cm；管內線性電壓500 V/cm；漂移管溫度45 ℃；IMS溫度45 ℃。

1.3.3 數據處理

使用風味分析儀配套的分析軟件VOCal用于分析譜圖和數據的定性定量，應用軟件內置的美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）數據庫和IMS數據庫可對物質進行定性分析。運用Reporter插件直接對比樣品之間的譜圖差異（二維俯視圖、三維譜圖和差異譜圖）。使用Gallery Plot插件進行指紋圖譜對比。應用Dynamic PCA插件，制作動態主成分分析和相似度分析圖。

2 結果與分析

2.1 不同年份黃酒揮發性風味物質GC-IMS圖譜分析

不同年份黃酒樣品揮發性風味物質的氣相色譜-離子遷移譜見圖1。橫坐標1.0處紅色豎線為反應離子峰（reactive ion peak，RIP），RIP峰兩側的每一個點代表一種揮發性有機物。顏色代表物質的濃度，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，顏色越深表示濃度越大。由圖1可知，黃酒樣品中揮發性有機物成分在2 500 s完成GC分離，在2 ms內完成IMS分離。大部分化合物能夠在前1 000 s內出峰并有較好分離度。6個不同貯藏年份黃酒樣品檢測到的揮發性有機物種類大致相同，但各物質在含量上有所區別，隨貯藏年份的延長而含量增高的揮發性成分可能對黃酒的風味具有重要貢獻，可作為提升黃酒品質的參考依據。

圖1 不同年份黃酒樣品揮發性風味物質的氣相色譜-離子遷移譜圖Fig.1 Gas chromatography-ion migration chromatography of volatile flavor substances in Huangjiu samples with different years

2.2 不同年份黃酒的揮發性風味物質分析

通過GC-IMS檢測出的揮發性風味物質檢測結果見表1。由表1可知，6個不同貯藏年份黃酒樣中共檢出63種揮發性成分，其中，醇類11種，酯類27種，酮類8種，醛類6種以及其他類11種。酒樣A08、A10、A12、A14、A18、A19的揮發性風味物質分別檢出62種、61種、63種、62種、59種，其中，共有成分58種。6個樣品的黃酒揮發性風味物質的總含量基本上隨著年份的增長而逐漸減少，其揮發性風味物質總含量分別為955.42 μg/L、758.62 μg/L、593.8 μg/L、581.08 μg/L、528.89 μg/L、536.66 μg/L，其中，6個樣品中檢出揮發性風味物質為醇類、酯類、醛酮類物質等。這與王琳[15]通過頂空固相微萃取和氣質聯用法檢測古南豐三年陳、五年陳、六年陳、八年陳和十年陳的年份黃酒中揮發性風味物質總量整體呈下降趨勢的結果相符。

表1 不同年份黃酒中鑒定出的揮發性風味物質Table 1 Volatile flavor substances identified in different years of Huangjiu samples

酯類化合物是黃酒中最重要的風味化合物之一，酯類化合物在很大程度上可以決定黃酒所需的花香味、果香味等，酯類物質的不斷積累也是黃酒越陳越香一個原因[16]。酯類化合物的含量隨年份的增加而呈上升趨勢。樣品A08、A10、A12、A14、A18、A19的酯類物質中分別檢測出24種、27種、27種、25種、27種、27種，其總酯含量分別為55.64 μg/L、62.13 μg/L、71.02 μg/L、76.61 μg/L、76.79 μg/L、92.56 μg/L。共有成分23種，分別為乙酸烯丙酯、醋酸冰片酯、乙酸丁酯、丙酸丁酯、2-甲基丁酸乙酯、二甲基戊酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、3-甲基戊酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、甲酸乙酯、己酸乙酯、異丁酸乙酯、乳酸乙酯、丙酸乙酯、甲酸香葉酯、己基丁酸酯、乙酸異戊酯、乙酸異丁酯、甲酸異丁酯、丁酸異丙酯、2-糠酸甲酯、2-甲基丁酸甲酯、3-甲基丁酸甲酯。根據相關研究可知，乙酯類化合物的數量及其含量則在酯類化合物中占有絕對性的優勢[9]。在本研究中，乙酸乙酯和乳酸乙酯同樣在酯類中占比較大，黃酒樣品A08、A10、A12、A14、A18、A19中乙酸乙酯和乳酸乙酯的質量濃度范圍分別為12.47～23.16μg/L和11.65～30.21μg/L。乳酸乙酯具有水果香、奶油味[17]，而乙酸乙酯呈香蕉味、草莓味[18]，二者是對黃酒香氣影響較大的物質。彭金龍等[19]添加不同糖化劑釀造黃酒，并對3種不同糖化劑所釀造的黃酒的部分揮發性風味物質進行檢測，結果表明，乳酸乙酯與乙酸乙酯同樣在酯類化合物中占比較大。

黃酒揮發性風味物質含量中占比最大的物質為醇類化合物，醇類化合物可由糖代謝、氨基酸脫氫脫羧作用產生，是陳化的酯類化合物的前體物質[20]。本研究中，6個黃酒樣品的醇類物質中共檢出11種，其總醇含量分別為867.21 μg/L、667.87 μg/L、494.43 μg/L、478.35 μg/L、424.51 μg/L、414.19 μg/L，醇類化合物含量隨著貯藏時間的增長呈現下降趨勢。江偉等[21]采用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法檢測了不同酒齡的黃酒中34種風味物質，結果表明，在陳釀期間醇類化合物呈下降趨勢，這與本研究結果相同。

醛酮類化合物同樣是黃酒中重要揮發性物質之一，樣品A08、A10、A12、A14、A18、A19的醛酮類物質中分別檢測出13種、13種、14種、14種、13種、13種，共有物質13種。其中總酮含量分別為3.45μg/L、2.44μg/L、2.28μg/L、2.13μg/L、2.03 μg/L、1.64 μg/L，整體呈下降趨勢；同樣，總醛含量分別為16.24 μg/L、13.44 μg/L、11.29 μg/L、10.47 μg/L、9.01 μg/L、8.27 μg/L，有明顯的下降趨勢。醛酮類化合物通常具有特殊的香氣，與酸類化合物對總體香氣起到協調、融合的作用[22]，如糠醛呈焦糖香、苦杏仁香，這可使得黃酒具備與其他酒類極其容易區分的特征[23]。

本研究中所檢出的酸類、蒎烯、醛類均有明顯變化趨勢，各有其獨特的呈香特點，對黃酒風味物質的形成具有不容忽視的作用。由結果可知，醇類與酯類是黃酒中的主要揮發性風味物質，葛東穎等[24]采用電子鼻和氣相色譜-質譜聯用技術對不同原料釀造黃酒的風味品質進行比較研究發現，醇類和酯類物質為黃酒中最為重要的揮發性化合物，YE Y T等[25]采用氣相色譜-嗅覺法（gas chromatography-olfactometry，GC-O）和氣味活性值（odour active value，OAV）結合多變量數據分析，評價了15個不同發酵階段制備的黃酒樣品，證實醇類和酯類物質是黃酒中主要的揮發性風味物質。

2.3 不同年份黃酒GC-IMS指紋圖譜分析

為了進一步比較不同年份黃酒樣品中揮發性風味成分之間的差異，通過GC-IMS自帶的Gallery Plot軟件繪制指紋圖譜，不同年份黃酒樣品中揮發性風味物質指紋圖譜見圖2。圖中每一橫行表示一個樣本的圖譜，每個樣本進行3次重復，右側為樣本名稱，每一縱列表示為一種揮發性成分，下側為揮發性成分的名稱，其中點越紅表示化合物的相對含量越高[21]。由圖2可知，2-甲基1-丙醇、丁醇、乙醇、甲醇等醇類物質和丁酸乙酯、己基丁酸酯、十六烷內酯等酯類物質隨黃酒年份增加逐漸增多。醋酸冰片酯、甲酸乙酯、2-乙酰基吡嗪、環己酮、乙醛等物質在酒樣A08中的含量略高于其余幾個年份黃酒，為其特征成分。乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸異丁酯、3-甲基丁酸甲酯、4-甲基戊酮、乙酸、己醛、四氫呋喃等物質在酒樣A10中的含量較高，為其特征成分。酒樣A12中特征成分比較多，3-甲基丁酸甲酯、3-甲基戊酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸異丙酯、2-糠酸甲酯、2-甲基丁酸甲酯、乙酸烯丙酯、反式-2-戊烯醇、2-甲基丙烷、正丁醛、庚醛、二丁酮、4-甲基-3-戊烯-2-酮、1,4-二惡烷、丙醇等物質在酒樣A12中含量較高。丙酸丁酯、2-甲基丁酸甲酯、二甲基戊酸乙酯、己酸乙酯、異丁酸乙酯、戊酸乙酯、γ-萜品烯、2-戊酮等物質在酒樣A14中含量較高，為其特征成分。2-甲基丁醇在酒樣A18中含量較高，為其特征成分。巴豆酸乙酯、乙酸丁酯、2-辛酮、3-（甲基異丙醇）-1-丙醇、辛醛等物質在酒樣A19中含量較高，為其特征成分。結果表明，指紋圖譜可根據以上特征成分判斷不同年份黃酒樣品中揮發性風味物質組成的主要差異。

圖2 不同年份黃酒樣品中揮發性風味物質氣相色譜-離子遷移譜指紋圖譜Fig.2 GC-IMS fingerprint map of flavor substances in different years of Huangjiu samples

2.4 不同年份黃酒揮發性風味物質主成分分析結果

主成分分析是識別算法中最基本的多元統計方法，同時能夠利用降維的思想，將多指標轉變為少數綜合指標[22]。本研究以63種揮發性風味物質的峰強度作為分析對象，對不同年份黃酒進行主成分分析，結果見圖3。由圖3可知，主成分1與主成分2的累計方差貢獻率為69%，表明該數據可以很好地反映樣品的整體信息。其中，不同年份黃酒樣品平行樣間緊密聚集，表示樣品間重復性較高，6個樣本之間則有一定距離，樣品A18和A19之間距離較近，具有一定相似性；樣品A08和A10之間距離較近，同樣具有一定相似性；其余樣品距離較遠，表明隨著年份的增加樣品揮發性物質發生了很大變化。結果表明，陳釀時間對酒體香氣的影響顯著，陳釀時間間隔越久，酒體香氣變化越明顯。說明PCA具有較好的分類效果，能直觀的鑒別不同年份黃酒間的差異。

圖3 不同年份黃酒樣本的主成分分析結果Fig.3 Principal component analysis results of different years of Huangjiu samples

2.5 聚類分析結果

樣本間歐氏距離對應于最鄰近分析圖，樣品間差距越大，歐氏距離數值越大[23]。以63種揮發性風味物質峰強度作為分析對象進行最鄰近分析，結果見圖4。圖中樣品之間的距離最近，說明兩者的相似度最高；反之距離較遠，酒體風格則迥然不同。

圖4 不同年份黃酒樣品聚類分析結果Fig.4 Cluster analysis results of different years of Huangjiu samples

由圖4可知，樣品A08與A10最相近，與樣品A19差異最大；而樣品A12與樣品A18和A19差異最大；樣品A14與兩個樣品A18和A19更相似，與樣品A12差異最大；兩個樣品A18和A19彼此之間比較相近，均與樣品A12差異最大。結果表明，陳釀時間較長的黃酒可明顯區別于陳釀時間較短的黃酒，說明在陳釀過程中，酒體會發生明顯的變化，這一結論與主成分分析結果一致。

3 結論

本研究利用GC-IMS探究6個不同年份黃酒中揮發性風味物質的組成和變化規律，共檢出63種揮發性風味物質，包括醇類11種，酯類27種，酮類8種，醛類6種以及其他類11種。GC-IMS結果表明，不同年份黃酒痕量組分和整體風味輪廓具有差異，其中，酒樣A08特征成分為甲酸乙酯、己基丁酸酯、丁酸乙酯等，酒樣A10特征成分為乙酸乙酯、乳酸乙酯等，酒樣A12特征成分為3-甲基丁酸甲酯、3-甲基戊酸乙酯、丙酸乙酯等，酒樣A14特征成分丙酸丁酯、2-甲基丁酸甲酯等，酒樣A18特征成分為2-甲基丁醇，酒樣A19特征成分為巴豆酸乙酯、乙酸丁酯等。主成分分析和聚類分析結果表明，酒樣A18和A19之間具有相似性，酒樣A08和A10之間具有相似性，而其余酒樣均不具有相似性，表明在陳釀過程中，酒體會發生明顯的變化。由于對酯類和醇類物質探測的高靈敏度等優勢，GC-IMS可作為一種快速鑒定年份黃酒的檢測手段，本研究結果可為黃酒的年份鑒別和質量控制提供經驗借鑒和應用思路。