甜香型甘蔗甜茶酒發酵工藝優化及品質分析

陳 碧，李爐娟，郭 松，3，陳思柳，王小明*

（1.廣西科技師范學院 食品與生化工程學院，廣西 來賓 546199；2.廣西科技師范學院 糖料蔗綠色高效生產技術重點實驗室，廣西 來賓 546199；3.廣西科技師范學院 壯瑤藥品質生物學重點實驗室，廣西 來賓 546199）

甜茶是集糖、茶、藥于一體的食藥同源類植物，也是壯族、瑤族等少數民族地區的常用藥物[1]，含有豐富的甜茶素、茶多酚和多種礦物質元素等物質，其中甜茶素和茶多酚具有降血壓、降血糖、促進代謝等作用[1-2]。甜茶素具有甜度高、熱量低、甜味舒適和風味獨特等特點，作為一種低熱量的天然非糖甜味劑被廣泛應用于各種食品的加工中[3-4]。甘蔗含糖量高并含有豐富的維生素、有機酸、多酚類及礦物質元素[5-6]和風味物質[7]。

發酵性茶酒因富含多糖、茶色素、茶多酚、氨基酸和咖啡堿等成分而具有保健醫療[8-10]等功能，其是以茶葉和茶湯為原料，但由于咖啡堿含量不易控制或原材料選擇不當而造成多數產品存在滋味不協調、苦澀味、香氣不豐富等現象[11-12]，亟需通過原材料或生產工藝改善其品質。因此，本試驗選用富含甜茶素的甜茶和高糖分的甘蔗汁作為原材料，通過甜茶中的甜味素調和由茶堿產生的苦澀味，以甘蔗汁中糖分為發酵提供能量，將兩種原材料的特性有機的融合和利用，在改善茶酒口感的基礎性上保留了甜茶和甘蔗的營養價值及風味，有利于延長茶葉和甘蔗產業鏈，提高甜茶和甘蔗資源的利用率和效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘蔗：廣西來賓市售；甜茶：采摘于廣西金秀瑤族自治縣蓮花山；果酒專用RW酵母：湖北省安琪酵母股份有限公司。

福林酚（1 mol/L）：上海源葉生物試劑有限公司；蘆丁標準品（純度≥95%）、沒食子酸（純度≥95%）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、碳酸鈉（均為分析純）：西隴科學股份有限公司。

1.2 儀器與設備

6890B-5977型氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：美國安捷倫公司；UV-2600紫外可見分光光度儀：島津企業管理有限公司；SPX-250型生化培養箱、DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海申賢恒溫設備廠；WYA阿貝折射儀：上海儀電物理光學儀器有限公司；pHS-3E pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甜香型甘蔗甜茶酒發酵工藝流程及操作要點

甜茶汁制備[13]：甜茶葉用粉碎機粉碎1.0 min后過20目篩，采用超聲波結合水浴的方法進行浸提，提取條件為料液比1∶25（g∶mL）、提取溫度73 ℃、提取時間31 min，得到的甜茶提取液于高速離心機中3 600 r/min離心10 min。重復以上步驟兩次，合并甜茶提取液后于60 ℃恒溫濃縮。

甘蔗汁的制備：選用新鮮，無霉變和病蟲害的甘蔗，經清洗、壓榨、過濾，采用蒸餾水將甘蔗汁初始糖度調整為18°Bx。

菌種活化：將3.5 g果酒專用RW酵母緩緩加入38 ℃的100 mL水中活化，靜置10 min后攪拌，冷卻后加入發酵液中。

成份調配與發酵：將18°Bx甘蔗清汁和茶濃縮汁按照質量比為100∶3混合（以不添加茶濃縮汁的甘蔗清汁制備甘蔗酒），用檸檬酸溶液調整pH為3.8后滅菌，接種3.5%已活化酵母25 ℃發酵5 d。

離心、澄清：原酒置于高速離心機中4 000 r/min離心10 min，得到澄清的成品并裝瓶。裝瓶酒樣采用巴氏滅菌法（63 ℃殺菌30 min）滅菌，即得甜香型甘蔗甜茶酒。

1.3.2 甜香型甘蔗甜茶酒發酵工藝優化

（1）單因素試驗

以甜香型甘蔗甜茶酒的酒精度和感官為評價指標，考察甜茶汁添加量（相對于甘蔗汁的百分含量）、酵母接種量、發酵溫度3個因素對甜香型甘蔗甜茶酒品質的影響。

在甘蔗汁的糖度16.0 °Bx、酵母添加量3.5%、發酵溫度25.0 ℃，發酵時間5 d的條件下，考察甜茶汁添加量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）對甜香型甘蔗甜茶酒品質的影響。

在甘蔗汁的糖度16.0°Bx、甜茶汁添加量3.0%、發酵溫度25.0 ℃、發酵時間5 d的條件下，考察酵母接種量（1.5%、3.5%、5.5%、7.5%、9.5%）對甜香型甘蔗甜茶酒品質的影響。

在甘蔗汁的糖度16.0°Bx、甜茶汁添加量3.0%、酵母添加量3.5%，發酵時間5 d的條件下，考察發酵溫度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃）對甜香型甘蔗甜茶酒品質的影響。

（2）響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇甜茶汁添加量（A）、酵母接種量（B）、發酵溫度（C）3個因素為自變量，以感官評分（Y）為響應值，采用Box-Behnken（BBD）響應面設計3因素3水平試驗優化甜香型甘蔗甜茶酒發酵工藝[14-16]，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 甜香型甘蔗甜茶酒發酵工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for fermentation conditions optimization of sweet sugarcane tea wine

1.3.3 感官評價方法

甜香型甘蔗甜茶酒感官評價：參考已有茶酒的評價標準[14-16]和GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[17]，并根據本產品特性做適當調整，由10名受過感官評分培訓的食品專業人員，從色澤、香氣、口感、風格4項進行感官評分，取10人平均分，滿分100分。感官評分標準見表2。

表2 甜香型甘蔗甜茶酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of sweet sugarcane tea wine

1.3.4 理化指標測定

酒精度：按照GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》的酒精計法進行[17]；可溶性固形物：采用阿貝折光儀測定；總黃酮含量：采用亞硝酸鈉—硝酸鋁法測定；總酚含量：采用Folin-Ciocalteau法測定[18]；pH、總酸：按照GB/T 13362—2018《黃酒》測定[19]。

1.3.5 揮發性香氣成分分析

香氣富集：參考譚敏華等[20]的方法并稍作修改。取8.0 mL甜香型甘蔗甜茶酒、甘蔗酒加入15.0 mL樣品瓶，隨后加入1.0 g NaCl，并在樣品瓶中加入攪拌子。用萃取頭（DVB/CAR/PDMS 57348-U）在40 ℃條件下萃取40 min，于氣相色譜進樣口解吸5 min進行氣相色譜-質譜分析。

氣相色譜條件：DB-WAX毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 mm）；載氣為氦氣（He）；進樣口溫度250 ℃；程序升溫：35 ℃保持8 min，以2 ℃/min升至150 ℃，再以4 ℃/min升至210 ℃，保持10 min；柱流量0.8 mL/min；不分流進樣。

質譜條件：質量掃描范圍35～550 amu；離子源溫度230 ℃；電離方式：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；傳輸線溫度230 ℃。

定性定量方法：選取匹配度≥80%的物質，通過美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）14譜庫與揮發性化合物譜圖進行比對，結合相關資料及文獻進行分析和鑒定進行定性；采用峰面積歸一法進行定量。

1.3.6 數據處理

試驗結果采用Origin pro 2018軟件進行單因素及曲線回歸分析和制圖，單組別試驗重復3次，試驗結果用“平均值±標準差”。采用SPSS19.0進行單因素方差分析、采用Design-Expert 8.0.6軟件設計Box-Behnken（BBD）試驗并進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 甜香型甘蔗甜茶酒發酵工藝優化單因素試驗

2.1.1 甜茶汁添加量對甜香型甘蔗甜茶酒品質的影響由圖1可知，隨著甜茶汁添加量的增加，甜香型甘蔗甜茶酒的酒精度呈先緩慢后較快速下降的趨勢，感官評分呈先快速升高后緩慢降低的趨勢；當甜茶汁添加量為3%時，甜香型甘蔗甜茶酒茶味明顯，口感回甘綿延，呈淺棕黃澄清透明發亮，感官評分最高為85.10分，此時酒精度也較高為8.41%vol；當甜茶汁添加量為4%和5%時甜香型甘蔗甜茶酒酒精度下降較明顯可能是因為隨著甜茶汁添加量增加，茶濃縮汁中較高濃度的生物堿濃度從而抑制了酵母菌的生長，導致酒精度降低[21]。綜合考慮，選擇甜茶汁添加量為3%時較為合適。

圖1 甜茶汁添加量對甜香型甘蔗甜茶酒酒精度和感官評分的影響Fig.1 Effect of different sweet tea juice addition on alcohol content and sensory score of sweet sugarcane tea wine

2.1.2 酵母接種量對甜香型甘蔗甜茶酒品質的影響

由圖2可知，隨著酵母接種量的增加，感官評分和酒精度先升高后下降。當酵母接種量為3.5%時，感官評分最高為85.90分，此時酒精度為8.87%vol；當酵母接種量超過3.5%時，酒精度和感官評分都呈現下降趨勢，這是因為當酵母接種量過高，樣品起酵快，然而發酵液營養基質有限，造成發酵液中糖分不足，導致果酒中乙醇下降[22-23]；同時發酵過快導致過多的酵母活力不足甚至死亡，造成酒體粗糙，香氣不足、酵母味較重，影響甜香型甘蔗甜茶酒的品質和風味[16]。因此，酵母接種量為3.5%時，甜香型甘蔗甜茶酒的發酵效果和品質最好。

圖2 酵母接種量對甜香型甘蔗甜茶酒酒精度和感官評分的影響Fig.2 Effect of yeast inoculum on alcohol content and sensory score of sweet sugarcane tea wine

2.1.3 發酵溫度對甜香型甘蔗甜茶酒品質的影響

由圖3可知，發酵溫度由15 ℃升高至25 ℃時，隨著發酵溫度的升高甜香型甘蔗甜茶酒的酒精度和感官評分逐漸升高，當發酵溫度為25 ℃時，感官評分最高為90.50分，此時酒精度為8.89%vol；當溫度超過25 ℃時，甜香型甘蔗甜茶酒的隨著發酵溫度升高酒精度和感官評分呈現下降趨勢。這是因為當發酵溫度低于25 ℃時，酵母的活性較低和生長較慢，導致酒精度低和香氣不足[23]；當發酵溫度高于25 ℃時，出芽率和發酵速度過快，使其發酵動力不足，使其酒精度數降低，同時也會導致茶葉中香味成分的揮發，導致香味物質的產生不充分，對甜香型甘蔗甜茶酒的香味產生不利影響[15，23]。綜合考慮，選擇發酵溫度為25 ℃時較為合適。

圖3 發酵溫度對甜香型甘蔗甜茶酒酒精度和感官評分的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content and sensory score of sweet sugarcane tea wine

2.2 甜香型甘蔗甜茶酒發酵工藝優化響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面試驗結果

采用Design Expert 8.0.6軟件對考察各因素水平進行響應面分析，結果見表3，方差分析結果見表4。對表3試驗結果進行二次多項回歸擬合，得到以甜香型甘蔗甜茶酒感官評分（Y）作為響應值的回歸方程：Y=91.56-0.64A+1.07B+0.59C+0.092AB-0.28AC-0.4BC-2.57A2-3.50B2-4.01C2。

表3 甜香型甘蔗甜茶酒發酵工藝優化響應面試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of response surface methodology for fermentation conditions optimization of sweet sugarcane tea wine

表4 回歸模型果方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model

根據表4可知，該模型具有極顯著性（P＜0.01），失擬項P=0.348＞0.05，不顯著，說明二次多項回歸模型顯著。該模型決定系數R2=0.998 5，證明有99.85%響應值的變化能用該模型來解釋，表明該模型適用分析相關因素與響應值的關系。根據F值的大小，可以判斷各因素對感官評價的影響順序為酵母添加量（B）＞甜茶汁添加量（A）＞發酵溫度（C）。根據P值可知，一次項A、B、C，二次項A2、B2、C2和交互項BC對結果具有極顯著性影響（P＜0.01），交互項AC對結果具有顯著性影響（P＜0.05）。

2.2.2 響應面交互作用分析

根據曲面的陡峭程度來分析任意兩個變量的交互關系。由圖4a可知，曲面斜率較平緩，A、B因素交互作用不顯著；由圖4b可知，曲面斜率較陡峭，表明A、C因素交互作用顯著，與表4試驗結果相符；由圖4c可知，曲面斜率陡峭，表明B與C交互作用極顯著，與表4中試驗結果相符，表明AC和BC對甜香型甘蔗甜茶酒感官評價影響較大。

圖4 各因素間交互作用對甘蔗糖茶酒品質影響的響應面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between various factors on the quality of sugarcane sweet tea wine

利用Design Expert 8.0.6軟件對上述回歸模型進行極值分析，得到預測最佳發酵工藝條件為甜茶汁添加量2.87%、酵母接種量3.79%、發酵溫度25.32 ℃，在此條件下甜香型甘蔗甜茶酒的感官評分預測值為91.70分?？紤]到實際可操作性，修正發酵工藝條件為甜茶添加量2.9%、酵母接種量3.8%、發酵溫度25.3 ℃，在此條件下進行3組平行試驗，得到甜香型甘蔗甜茶酒的酒精度為（8.9±0.08）%vol，感官評分平均實際值為92.5分，所得結果與預測結果值接近，表明該模型所得的優化條件準確可靠。

2.3 產品指標分析

2.3.1 基本理化指標

由表5可知，甜香型甘蔗甜茶酒的酒精度為（8.94±0.08）%vol、pH為3.74±0.01、總酸含量為（4.74±0.05）g/L，甜茶中豐富的無機酸和有機酸類保證了甜香型甘蔗甜茶酒獨特醇厚的風味。甜香型甘蔗甜茶酒具有較高的清澈度，亮度L*值為84.17±0.23；亮度較高，a*值為2.92±0.17，相對于甘蔗酒增加3.79，偏向紅色調；b*值為51.17±0.72，相對于甘蔗酒增加34.25，偏向黃色調；酒體通透有光澤且呈現落日般的微紅黃色，其結果與感官評價吻合。

表5 甜香型甘蔗甜茶酒與甘蔗酒理化指標測定結果Table 5 Determination results of physicochemical indexes of sweet sugarcane tea wine and sugarcane wine

2.3.2 抗氧化成分和能力分析

由表6可知，甜香型甘蔗甜茶酒總黃酮、總酚含量分別為120.99 mg/100 g、67.10 mg/100 g，較甘蔗酒總黃酮和總酚分別高75.01 mg/100 g、49.63 mg/100 g；甜香型甘蔗甜茶酒的總黃酮和總酚有助于增強其抗氧化能力，經測定，其DPPH自由基清除率為87.34%，這是由于甜茶含有豐富的茶多酚[9，12]等活性成分，有效提高了甜香型甘蔗甜茶酒的抗氧化能力[4，13]。

表6 甜香型甘蔗甜茶酒與甘蔗酒抗氧化成分及能力結果Table 6 Determination results of antioxidant components and capacity of sweet sugarcane tea wine and sugarcane wine

2.3.3 甜香型甘蔗甜茶酒揮發性香氣成分分析

利用GC-MS從甜香型甘蔗甜茶酒與甘蔗酒中共檢測出24種揮發性香氣成分（見表7），其中甜香型甘蔗甜茶酒中檢出20種揮發性香氣成分，包括酯類7種、醇類6種、有機酸類3種、酚類1種、酮類1種、烷烴類2種；甘蔗汁酒中檢出18種揮發性香氣成分，包括酯類4種、醇類5種、有機酸類4種、酚類1種、酮類1種、烷烴類2種、胺類1種。添加甜茶后，甜香型甘蔗甜茶酒酯類化合物和醇類化合物的數量增多，分別比甘蔗酒增加了4和1種。甜香型甘蔗甜茶酒中檢測出來的酯類化合物有乙酸- 2-叔丁基-4-（二氟甲基）-1,3-惡唑-5-羧酸-2-苯基酯、甲酸己酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙基-9-癸烯酸酯、肉桂醇丙酸酯7種，其中辛酸乙酯相對含量為9.39%，賦予甘蔗茶酒果香和甜香[25]，癸酸乙酯相對含量為2.94%，賦予甘蔗茶酒菠蘿香、花香[26]，甜香型甘蔗甜茶酒特有四種酯類賦予其蘋果和未成熟梅子似甜香氣、果香和甜香及葡萄、草莓香[27]，甜香型甘蔗甜茶酒豐富的香氣是由于甜茶汁和甘蔗汁在酵母厭氧代謝過程中產生，使其呈現馥郁、迷人、獨特的甜香和茶香。

表7 甜香型甘蔗甜茶酒與甘蔗酒揮發性香氣成分GC-MS測定結果Table 7 Determination results of volatile aroma compounds of sweet sugarcane tea wine and sugarcane wine by GC-MS

3 結論

以甜茶和甘蔗汁為主要原料制備甜香型甘蔗甜茶酒，通過單因素試驗和Box-Behnken中心組合響應面設計確定甜香型甘蔗甜茶酒的最優發酵工藝條件為甜茶汁添加量2.9%、酵母接種量3.8%、發酵溫度為25.3 ℃，此時甜香型甘蔗甜茶酒感官評分為92.5分、酒精度為8.9%vol。不僅豐富茶酒口感和香氣，同時保留了甜茶和甘蔗的天然營養活性成分。研究表明在最佳發酵工藝下制作甜香型甘蔗甜茶酒，具有茶清香、甘蔗果香和回甘綿長等特點，在調和茶酒苦澀味和豐富酒香的基礎上，增加茶酒中總酚、總黃酮的含量及提高抗氧化能力，總酚和總黃酮含量分別為67.10 mg/100 g、120.99 mg/100 g，DPPH自由基清除率為87.34%。