菌酶協同轉化白酒丟糟制備微晶纖維素及Nisin工藝條件優化

張小利，黃銀峰，張鵬翔，張華應，李雅麗，鞏東輝，白果云

（1.內蒙古科技大學 生命科學與技術學院，內蒙古 包頭 014010；2.內蒙古自治區生物質能源化利用重點試驗室，內蒙古 包頭 014010；3.包頭海關綜合技術服務中心，內蒙古 包頭 014010；4.包頭市遼禾淵酒廠，內蒙古 包頭 014060）

我國白酒生產企業每年產生的酒糟約3 600萬t以上[1]。國內中小企業通常采取直接將白酒糟低價（約0.5元/kg）銷售給養殖戶；然而相比其他農副產品，牲畜難以消化吸收鮮酒糟，而且酒糟含水量高，極易腐敗霉變，因此，酒糟并不受養殖戶歡迎[2]。除此之外，酒糟還被用來作為營養物質、有機肥、可發酵碳源、制備微晶纖維素（microcrystalline cellulose，MCC）等[3-6]。雖然這些酒糟的處理方法有一定的成效，但相關產品附加值低，收益微薄，以致于出現中小白酒企業再度丟棄酒糟的現象。酒糟中富含粗纖維、粗淀粉、粗蛋白、粗脂肪等有機質[7]，是一種極具開發潛力的可再生資源，研究一條體系化、高值化、環保的丟糟高值化利用途徑迫在眉睫。

MCC具有獨特的理化性質，在食品、日用化工和醫藥領域有廣泛應用[8]。制備MCC方法主要有酸水解法、酶水解法、近臨界水法等[9-11]。其中，酸水解法對設備有很強的腐蝕性，廢液的排放容易造成環境污染，用強酸制備MCC已不符合新時代發展的要求。近臨界水法需要在高壓高熱環境中進行，設備昂貴、能耗大、成本高，不適宜工業化生產。酶水解法制備MCC反應條件溫和、副反應較少[10]，而且多種酶耦合使用可以有效除去目標物中的蛋白質、淀粉、脂肪等其他物質而得到MCC[7，11]；制備過程中產生的廢水是可以被生物直接利用的生物質。乳酸鏈球菌素（Nisin）是由乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）產生的一個多肽抗菌物質，是國際上允許商業化生產食品防腐劑，具有極高的商業價值[12]。目前，有菌酶協同發酵酒糟生產蛋白飼料的研究報道[13-14]，但未見菌酶協同將丟糟轉化為MCC和Nisin的研究。

本研究以包頭市遼禾淵酒廠“粹五燒”酒的丟糟為研究對象，采用單因素試驗及正交試驗對復合酶耦合乳酸乳球菌協同制備微晶纖維素（MCC）的工藝條件進行優化，并對MCC的結構進行表征。以乳酸乳球菌生物量為評價指標，采用MCC制備過程中廢水培養基培養乳酸乳球菌產Nisin，并采用單因素試驗及響應面法對其培養基組分進行優化。以期實現菌酶協同高值化利用丟糟，為實現原料丟糟高值化利用、控制污染問題和增加效益的一體化技術體系提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

白酒丟糟（釀酒原料由稻米、小麥、高粱、玉米和豌豆構成）：包頭市遼禾淵酒廠“粹五燒”牌；乳酸乳球菌（Lactococcuslactissubsp.lactis）F44、藤黃八疊球菌（Sarcina lutea）：中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑

堿性蛋白酶（200 000 U/g）：北京索萊寶科技有限公司；脂肪酶（酶活20 000 U/g）、酸性木聚糖酶（酶活200 000 U/g）、漆酶（酶活700 U/g）、α-中溫淀粉酶溶液（酶活4 154 U/mL）：山東蘇柯漢生物工程公司；纖維素酶（酶活3 U/mg）：美國Worthington公司。

1.1.3 培養基

乳酸乳球菌產Nisin的培養基[12]：酵母浸粉15 g/L、蛋白胨15 g/L、蔗糖15 g/L、KH2PO420 g/L、NaCl 1.5 g/L和MgSO4·7H2O 0.15 g/L。121 ℃、0.11 MPa條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

S-4800場發射掃描電子顯微鏡：日本日立公司；KDN-08消化爐：上海洪紀儀器有限公司；KDN型-102C定氮儀：上海纖檢有限公司；1833品氏黏度計：上海寶山啟航玻璃儀器廠；UV-7504可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；GmbH高速冷凍離心機：德國Sigma公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 復合酶制備白酒丟糟基MCC[7，11，15-17]

稱取100 g白酒丟糟，105 ℃烘干、粉碎過20目篩，以料液比為1∶10（g∶mL）加水，煮沸半小時備用；按照2 U/g丟糟的α-中溫淀粉酶，保持pH 5.0和60 ℃條件下振搖（50 r/min、8 min）去除淀粉；按照30 000 U/g丟糟的比例加入堿性蛋白酶，保持在其pH 9.5和40 ℃條件下振搖（50 r/min、5 h）去除蛋白質；按照700 U/g丟糟的比例加入脂肪酶，在40 ℃下振搖（50 r/min、6 h）去除脂肪；按照10 000 U/g丟糟的比例加入酸性木聚糖酶，在pH 9.5和40 ℃條件下振搖（50 r/min、1 h），降解半纖維素；再按照70 U/g丟糟的比例加入漆酶，在pH 4.5和40 ℃條件下振搖（50 r/min）保溫2 h，降解木質素；之后，調節溶液pH值為9.5，加入次氯酸鈉使溶液中次氯酸鈉的終濃度為10%，室溫下作用3 h，直至纖維素漂成白色。最后，用醋酸使溶液pH值降至5.0，在50 ℃作用1 h消除次氯酸根，再用蒸餾水傾瀉洗滌法清洗3遍，烘干得丟糟基粗纖維。所得粗纖維加入1 000 mL蒸餾水，在pH 5.0、55 ℃條件下經纖維素酶酶解30 min，酶解完成后于5 000 r/min離心30 min并用蒸餾水沖洗，于真空干燥箱中干燥（60 ℃、6 h）獲得MCC。收集粗纖維及MCC制備過程中產生的廢水，每處理100 g丟糟約產生和收集2 000 mL廢水。

1.3.2 白酒丟糟基MCC酶解工藝條件優化

單因素試驗：按照上述制備粗纖維工藝流程，準確稱取所得丟糟基粗纖維，加入適量蒸餾水，調整pH在最佳，以所得丟糟基MCC的聚合度（degree of polymerization，DP）為評價指標，考察纖維素酶添加量（0、12 U/g、18 U/g、24 U/g、30 U/g和36 U/g）、酶解時間（0.5 h、1 h、3 h、5 h、7 h、9 h、11 h和13 h）和料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30）（g∶mL）進行酶水解丟糟基粗纖維制備MCC的最佳工藝條件。

正交試驗：依據單因素試驗結果，以所得丟糟基MCC的聚合度（degree of polymerization，DP）（Y）為評價指標，選取纖維素酶添加量（A）、酶解時間（B）和料液比（C）3個因素按L9（33）正交表進行試驗。正交試驗因素與水平見表1。

1.3.3 白酒丟糟中各有機成分的測定

粗纖維的測定：參考GB/T 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測定》；淀粉的測定：參考GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的測定》；蛋白質的測定：參考GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》；脂肪的測定：參考GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》；木質素的測定：參考GB/T 20805—2006《飼料中酸性洗滌木質素的測定》。

1.3.4 纖維素含量、持水力、白度和膨脹度的測定

白度：采用白度儀進行檢測。

纖維素含量的測定：參考文獻[18]。其計算公式如下：

式中：V1為硫酸亞鐵銨標液的消耗量，mL；X為試樣中纖維素的含量，%；m為所取試樣質量，mg；V2為滴定時消耗硫酸亞鐵銨標液的體積，mL；V1為空白試驗消耗硫酸亞鐵銨標液的體積，mL。

持水力的測定：參考據文獻[15]。其計算公式如下：

式中：3為丟糟基MCC的質量，g；V1為量筒中平整微晶纖維素體積，mL；V2：加入蒸餾水微晶纖維素在室溫下放置24 h后的體積，mL。

1.3.5 聚合度的測定

聚合度（DP）的測定按照GB/T 1548—1989《紙漿粘度的測定法》，配制銅乙二胺溶液，通過測定黏度換算聚合度[19]，用毛細血管黏度，取的測試時間平均值。根據時間換算得到η/η0，查黏度表得到[η]*c，再除以濃度c，得到[η]，DP計算公式如下：

DP0.905=0.75[η]

1.3.6 結構特性分析

將所得樣品粉末噴金后在場掃描電子顯微鏡上進行MCC的形貌和結構特性觀測[20]。

1.3.7 乳酸乳球菌產Nisin廢水培養基組分優化單因素試驗

在乳酸乳球菌產Nisin的種子培養基基礎條件下，經預試驗，以稀釋3倍的MCC廢水替代蒸餾水且不添加NaCl，分別考察復合氮源添加量（酵母浸粉和蛋白胨比例為1∶1）（0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L和25 g/L）、蔗糖添加量（0、2.5 g/L、5.0 g/L、7.5 g/L、10.0 g/L、12.5 g/L和15.0 g/L）、KH2PO4添加量（0、5.0 g/L、10.0 g/L、15.0 g/L、20.0 g/L、25.0 g/L、30.0 g/L和35.0 g/L）和MgSO4·7H2O添加量（0、0.05 g/L、0.10 g/L、0.15 g/L、0.20 g/L、0.25 g/L、0.30 g/L和0.35 g/L）對菌株F44生物量和Nisin產量的影響。

1.3.8 乳酸乳球菌產Nisin廢水培養基組分優化響應面試驗

在單因素試驗結果的基礎上，確定影響乳酸乳球菌生長的主要因素氮源添加量（A）、蔗糖添加量（B）和KH2PO4添加量（C），以乳酸乳球菌生物量（Y）為響應值進行響應面試驗，響應面試驗因素與水平見表2。

表2 培養基組分優化響應面試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments for medium components optimization

1.3.9 乳酸乳球菌生物量及其Nisin效價的檢測

生物量檢測：以稀釋涂布平板法計算乳酸乳球菌數量[12]。Nisin效價檢測：以藤黃八疊球菌為指示菌，使用管碟法通過對平板抑菌圈直徑的測量，以Nisin標準品液效價的對數值（Y）為縱坐標，抑菌圈的直徑（X）為橫坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程為：Y=0.187 9X-0.827 7（相關系數R2=0.992 8），通過測量待測樣品的抑菌圈直徑，代入相應標準曲線方程計算，即可得到Nisin效價。

2 結果與分析

2.1 白酒丟糟中有機質的測定結果

包頭市遼禾淵酒廠“粹五燒”牌白酒丟糟中各類有機質含量（以干基計）為纖維素23.5%、淀粉1.39%、蛋白質13.07%、脂肪7.41%、木質素14.30%。此丟糟中纖維素含量達23.50%。由此可知，此丟糟為制備MCC的良好來源。然而丟糟中含有較多的木質素、蛋白質、淀粉和脂肪，這些物質是制備MCC過程中需要去除的雜質。

2.2 白酒丟糟基MCC制備工藝條件優化單因素試驗結果

纖維素酶的酶解時間、纖維素酶添加量及料液比對MCC聚合度影響的單因素試驗結果見圖1。

圖1 白酒丟糟基微晶纖維素制備工藝條件優化單因素試驗結果Fig.1 Results of single factor experiments for optimization of preparation process conditions of Baijiu distiller's grains to prepare microcrystalline cellulose

由圖1A可知，隨著酶解時間在0～7 h內的延長，聚合度在不斷下降，說明丟糟微晶纖維素在不斷降解，解離速度較快，其原因可能是，中性鹽離子（Na+）等對纖維素酶具有激活作用[21]。當酶解時間為7 h，聚合度為137；當酶解時間＞7 h，聚合度下降比較平緩。這是因為隨著酶解時間的增加，剩余丟糟的木質纖維包被結構[11]，導致在開始階段使酶很難結合到其內部的酶反應結合位點，反應速率較低；當酶作用一段時間后，剩余木質纖維結構被逐步破壞，使酶結合位點增加；但隨著水解產物的增加，對酶解反應有抑制作用，丟糟MCC的平衡聚合度的酶解時間為7 h。因此，最佳酶解時間為7 h。

由圖1B可知，纖維素酶的添加量為0～12 U/g，聚合度快速下降，丟糟纖維素劇烈降解；纖維素酶的添加量為12 U/g時，聚合度為150；纖維素酶添加量＞12 U/g，聚合度的下降趨勢趨于平緩，丟糟MCC的解離基本達到平衡聚合度，其原因可能是，在酶解反應過程中，纖維素酶催化的產物有纖維二糖及葡萄糖，能降低酶解程度，抑制酶解反應[22]，這是導致酶解效率不高的主要因素。因此，最佳纖維素酶添加量為12 U/g。

由圖1C可知，當料液比為1∶10、1∶15、1∶20（g∶mL）時，聚合度有所下降，其原因可能是，隨著料液比的減小，混合酶體積增加，體系流動性加強，而且相同濃度酶液中的酶分子數量增加，提高了酶與底物的接觸面積和反應幾率，酶解作用加強[11]；當料液比為1∶20（g∶mL）時，丟糟微晶纖維素的聚合度值最低（230），其原因可能是料液較小時，反應底物濃度較高，體系流動性較差，溶液難以攪拌均勻，阻止了酶向纖維結構內部的滲透，致使酶與纖維素接觸面積變小，纖維素酶難以和底物充分接觸，難以發生酶解反應，導致酶解反應速率變慢[11]。當料液比為1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL）時，聚合度增加，其原因可能是溶液又經過稀釋，引起纖維素酶濃度降低。因此，最佳料液比為1∶20（g∶mL）。

2.3 白酒丟糟基MCC制備工藝條件優化正交試驗結果

根據單因素試驗結果，以丟糟基MCC聚合度為評價指標，選取纖維素酶的添加量（A）、酶解時間（B）和料液比（C）3個因素進行L9（33）正交試驗。正交試驗結果與分析見表3。

表3 白酒丟糟基微晶纖維素制備工藝條件優化正交試驗結果與分析Table 3 Results of orthogonal experiments for optimization of preparation process conditions of microcrystalline cellulose from Baijiu distiller's grains to prepare

由表3可知，3個因素對丟糟基MCC影響的主次順序為酶解時間＞加酶量＞料液比。另外，由k值可知，得到的最優組合為A3B3C2。即加酶量24 U/g，酶解時間9 h，料液比為1∶20。對最優酶解條件進行驗證，所得MCC的聚合度為118。

2.4 白酒丟糟基MCC的結構特性和主要性能指標參數

MCC的持水力為521%，膨脹度為1.27 mL/g，白度為88。丟糟基MCC掃描電鏡圖見圖2。由圖2可知，丟糟基MCC原來的纖維結構被破壞，現呈棒狀，粒徑約為20 μm。試驗所得丟糟基MCC與文獻[23]中由稻秸稈制成的MCC形態相似（圖3a）；與文獻[24]中由廢棉制成的纖維素形態有所差異，文獻中MCC形態（圖3b）沒有脫去木質素，所得MCC粒徑更大（20～50 μm），外觀較為平滑。

圖2 白酒丟糟基微晶纖維素掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscope of microcrystalline cellulose from Baijiu distiller's grains

圖3 文獻中的微晶纖維素掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscope of microcrystalline cellulose in literature

2.5 制備白酒丟糟基MCC過程廢水中有機質的含量

100 g丟糟制取MCC過程收集到約2 000 mL的廢水，廢水中各有機質含量為：總糖11.59g/L、蛋白質21.11g/L、脂肪酸2.10 g/L。另外，在粗纖維素漂白后Na+終濃度為0.12 mol/L。

2.6 乳酸乳球菌產Nisin廢水培養基組分優化

2.6.1 單因素試驗結果

由圖4A可知，隨著氮源添加量在5～15 g/L范圍內的增加，菌株的生物量明顯上升；氮源添加量為15 g/L時，生物量達最高值，為4.0×107CFU/mL；當氮源添加量＞15 g/L時，菌株的生物量有所下降。因此，最適氮源添加量為15 g/L。由圖4B可知，當蔗糖的添加量為0～7.5 g/L時，生物量逐漸增加；當蔗糖添加量為7.5 g/L時，生物量為6.3×107CFU/mL；當蔗糖添加量＞7.5 g/L時，生物量變化不明顯。因此，最適蔗糖添加量為7.5 g/L。由圖4C可知，當KH2PO4的添加量為0～15 g/L時，生物量逐漸增加；當KH2PO4添加量為15 g/L時，生物量達最大值，為6.3×107CFU/mL；當KH2PO4添加量＞15 g/L時，生物量逐漸下降。因為酒糟中含有豐富的微量元素，這些元素的存在，代替了一部分KH2PO4的作用，相對種子培養基的用量（20 g/L）降低了25%。因此，確定最適KH2PO4添加量為15 g/L。由圖4D可知，硫酸鎂的添加量為0～0.15 g/L時，生物量逐漸增加；硫酸鎂的添加量為0.15 g/L時，生物量達到最大值，為6.2×107CFU/mL；當硫酸鎂的添加量＞0.15 g/L時，生物量逐漸下降。因此，確定最適硫酸鎂添加量為0.15 g/L。

圖4 培養基組分優化單因素試驗結果Fig.4 Results of single factor tests for medium component optimization

2.6.2 響應面試驗結果

在單因素試驗結果基礎上，以生物量（Y）為響應值，選取氮源添加量（A）、蔗糖添加量（B）和KH2PO4添加量（C）3個自變量，采用中心組合試驗設計優化廢水培養基組分。培養基組分優化響應面試驗設計與結果見表4，回歸模型方差分析見表5。

表4 培養基組分優化響應面試驗設計與結果Table 4 Design and results of response surface tests for medium component optimization

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

通過Design-Expert8.0.6軟件對表3試驗數據進行多元回歸擬合，得到乳酸乳球菌生物量與氮源添加量、蔗糖添加量、KH2PO4添加量之間的二次多項回歸模型為：

由表5可知，模型的P值＜0.001，表明該回歸模型極顯著；失擬項P值=0.052 6＞0.05，不顯著，說明試驗設計可靠。決定系數R2=0.979 9，調整決定系數R2adj=0.943 8，表明該模型擬合度良好，由P值可知，一次項B、二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01），一次項C對結果影響顯著（P＜0.05）。由F值可知，3個因素對乳酸乳球菌生長量的影響順序依次為蔗糖添加量（B）＞KH2PO4添加量（C）＞氮源添加量（A）。

各因素間交互作用對菌株生物量影響的響應曲面和等高線見圖5。響應面圖越陡峭，等高線圖越接近橢圓，說明兩因素間交互作用對菌株生物量的影響越大。由圖5可知，蔗糖添加量（B）與KH2PO4添加量（C）響應曲面圖較陡峭，說明兩者具有一定交互作用。

圖5 各因素間交互作用對菌株生物量影響的響應曲面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on biomass of strain

2.6.3 驗證試驗

通過響應面軟件分析，得到最優培養基組分為：氮源16.78 g/L、蔗糖8.99 g/L、KH2PO419.10 g/L，在此優化條件下，乳酸乳球菌的生長量預測值為6.4×107CFU/mL。考慮實際應用，將最佳培養基組分修正為：氮源16 g/L、蔗糖9 g/L、KH2PO419 g/L，進行5次平行驗證試驗，得到乳酸乳球菌的生長量實際值為6.3×107CFU/mL，與預測值相差不大，因此，可用該模型對培養基組分進行預測。

2.7 不同培養基培養乳酸乳球菌產Nisin的結果

試驗測出工業常用培養乳酸乳球菌的種子培養基、本研究優化的廢水培養基和不外加氮源和碳源的培養基產生Nisin效價分別為487.75 IU/mL、732.52 IU/mL和49.23 IU/mL。Nisin效價與乳酸乳球菌生長量呈正相關，在上述效價值下乳酸乳球菌的生物量分別為6.4×107CFU/mL、6.3×107CFU/mL和0.4×107CFU/mL。優化的廢水培養基與種子培養基培養乳酸乳球菌在生物量上相差不大，但是優化的廢水培養基產Nisin的效價比種子培養基高了50.18%。可能是白酒丟糟廢水中除了含有蛋白質、淀粉、脂肪、木質素、纖維素外，還含有豐富的微量元素，這些微量元素對乳酸乳球菌的生長可能有非常好的促進作用，并且能大幅度提高nisin的產量。這類nisin產品主要應用于飼料防腐，尤其是豬飼料中。

3 結論

MCC的最佳制備工藝條件為纖維素酶加酶量0.8%，酶解時間9 h，料液比為1∶20（g∶mL），在此條件下，MCC聚合度為118，其結構呈棒狀。確定最佳酶解丟糟制備MCC過程中產Nisin的培養基組分為：酵母粉8 g/L和蛋白胨8 g/L、蔗糖9 g/L、KH2PO419 g/L、硫酸鎂為0.15 g/L，在此優化條件下，乳酸乳球菌生物量為6.3×107CFU/mL，Nisin效價為732.52 IU/mL。本研究利用酶法制備出的MCC與硝酸-乙醇法[9]制備丟糟MCC相比聚合度更低，綠色環保，并且對環境零負荷；同時把丟糟制備MCC過程產生的廢水用于培養乳酸乳球菌的碳氮源，進而轉化為高附加值的生物防腐劑Nisin。本研究真正實現了白酒丟糟的高值化利用，為發展以丟糟為原料的輕工產業，實現潔凈生產、原料高值化利用、控制污染問題和增加企業效益的一體化技術體系提供思路和方法指導。