人工培養窖泥中微生物菌群多樣性解析

楊少勇，賀子豪，李 娜，郭 壯，王玉榮*

（1.湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽 441053；2.釀造微生物研究與應用襄陽市重點實驗室，湖北 襄陽 441053）

濃香型白酒是中國十二大香型白酒之一，其生產工藝一般采用固態發酵[1]。在生產過程中最主要的發酵設備是窖池，窖池的質量與白酒的品質息息相關，而窖池的好壞本質上在于窖泥的品質[2]。窖泥本身是新鮮的土壤，在長期發酵過程中形成了一個獨特的微生物群落[3]。在窖池中，微生物以窖泥為載體，酒醅為營養物質，在生長繁殖時代謝出各種影響白酒品質的風味物質或風味前體物質[4]。然而，新建窖池一般至少經過20年的自然成熟期才能產出優質的白酒，這導致自然成熟窖泥的數量無法滿足白酒行業的快速發展[5]。因此，研究人員利用現代微生物技術培養出人工窖泥，大大縮短了窖泥自然成熟的時間。

人工窖泥的傳統培養方法是研究人員將發酵劑接種到按比例混合的新鮮土壤、自然成熟窖泥、豆粕和小麥的混合物中，然后在厭氧條件下培養30～60 d[6]。MU Y等[7]研究發現，在人工窖泥中添加強化大曲可以改變其原核微生物群落，從而提升人工窖泥的風味品質。魯少文等[8]在人工窖泥中添加前期研究發現的新型己酸菌可以大大縮短窖泥自然成熟的時間。

目前，對人工窖泥品質提升的研究較為深入，但關于人工窖泥中微生物群落結構的研究報道較少。本研究利用Illumina MiSeq高通量測序技術對采集自湖北省襄陽市的人工窖泥中微生物菌群多樣性及群落結構進行解析，以此探究人工窖泥中微生物群落組成，以期為人工窖泥培養方法的改良以及品質的提升提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

人工窖泥：于2022年10月在湖北省襄陽市某酒廠采集，共3份，編號為XF1～XF3。3份人工窖泥均由該酒廠自制：用含沙量低、粘性強、無污染的黃土做載體，輔以優質曲粉，高蛋白、高能量的農副產品以及優良醅糟、復合功能菌液、黃水和酒尾等原料，于溫度、水分、pH值等適宜的窖泥培養池中厭氧培養，采集的樣品均已厭氧培養50 d左右，采集后裝入無菌袋中迅速運回至實驗室，置于-40 ℃保存備用。

1.1.2 試劑

E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國Omega Bio-Tek公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）、DNA聚合酶（5 U/μL）、2×聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）mix：上海桑尼生物科技有限公司；引物338F/806R、ITS3F/ITS4R：武漢天一輝遠生物科技有限公司；DNA Marker、10倍緩沖液：青島蔚來生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Illumina MiSeq高通量測序平臺：美國Illumina公司；TG16MW微量高速冷凍離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；Vortex-2旋渦混勻儀：上海滬析實業有限公司；FluorChem HD2化學發光凝膠成像系統：普諾森生物科技（上海）有限公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Nano Drop公司；R930機架式服務器：美國DELL公司；S1000梯度PCR儀：美國Bio-Rad公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 人工窖泥樣品微生物菌群總基因組DNA的提取

稱取2.0 g混勻的人工窖泥樣品，按照基因組DNA提取試劑盒說明書對3份人工窖泥樣品的基因組DNA進行提取[9]，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗DNA的完整性和純度，檢驗合格并測定其濃度，置于-40 ℃儲存備用。

1.3.2 人工窖泥樣品微生物菌群PCR擴增及Illumina MiSeq高通量測序

以檢驗合格總基因組DNA為模板，使用帶有細菌特異性核苷酸標簽的引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對細菌16S rDNA的V3-V4區基因序列進行PCR擴增，PCR擴增反應體系和擴增程序參照周文等[10]的方法進行；使用帶有真菌特異性核苷酸標簽的引物ITS3F（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）和ITS4R（5'-TCCTCC-GCTTATTGATATGC-3'）對真菌ITS區基因序列進行PCR擴增，PCR擴增反應體系和擴增程序參照李斌等[11]的方法進行。合格的PCR擴增產物委托上海美吉生物技術有限公司的Illumina MiSeq平臺進行第二代高通量測序。

1.3.3 下機數據處理及生物信息學分析

測序返回的原始下機數據經過校正、拼接和質控等優化處理后得到合格的序列[12]。再經去除嵌合體序列后，得到優質序列。將優質序列上傳至QIIME（v1.7.1）平臺進行微生物多樣性評價。采用UPARSE軟件對優質序列以97%的相似度劃分并創建操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），選取具有代表性的OTU優質序列在GREENGENE數據庫[13]和核糖體數據庫項目（ribosomal database project，RDP）數據庫[14]中對細菌和真菌序列進行物種分類和注釋，并對人工窖泥樣品中微生物菌群多樣性進行計算。

1.3.4 數據處理

通過R軟件（v4.1.1）繪制韋恩圖，通過繪圖網站（http：//www.cloudtutu.com）繪制人工窖泥樣品中優勢菌門的物種豐度星圖和優勢菌屬的環狀熱圖，使用R軟件（v4.1.1）的corrplot包繪制樣品中優勢菌屬的相關性熱圖，其他可視化分析圖均由軟件Origin 2018繪制。

2 結果與分析

2.1 人工窖泥樣品微生物菌群的多樣性分析

對3份人工窖泥樣品的細菌和真菌共277 849條和163 359條原始下機序列進行質控，平均每份樣品包含92 614條細菌有效序列和54 453條真菌有效序列。在97%的相似度下劃分優質序列，共獲得12 128個細菌OTU和1 034個真菌OTU。人工窖泥樣品中細菌和真菌的稀疏曲線見圖1。

圖1 人工窖泥樣品中細菌（a）和真菌（b）菌群的稀疏曲線Fig.1 Rarefaction curve of bacterial (a) and fungal (b) communities in artificial pit mud samples

由圖1可知，隨著測序深度的增加，樣品中OTU的數量逐漸趨于飽和，只有少量新的OTU產生，說明樣品的測序量和深度合理，能夠真實的反映樣品中微生物多樣性，滿足后續分析的要求。由圖1亦可知，在同一測序深度下，XF2樣品的細菌菌群多樣性較其他樣品高，真菌菌群多樣性較其他樣品低。

為進一步探究樣品間微生物菌群的相似性和差異性，基于OTU水平對人工窖泥樣品的微生物進行韋恩圖分析，結果見圖2。

圖2 基于操作分類單元水平人工窖泥樣品中細菌（a）和真菌（b）的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of bacteria (a) and fungi (b) in artificial pit mud samples based on operational taxonomic unit level

由圖2可知，在細菌OTU水平上，XF1、XF2和XF3樣品中分別劃分出8 038、9 376和9 698個OTU，其中共有OTU為4 801個，占細菌總OTU數的17.71%；在真菌OTU水平上，XF1、XF2和XF3樣品中分別劃分出703、678和733個OTU，其中共有OTU數為383個，占真菌總OTU數的18.12%。由此可見，人工窖泥中微生物菌群組成較為豐富且存在一定的共有菌群。除此之外，各樣品中還包含有數量不等的細菌、真菌OTU序列，表明不同人工窖泥樣品的菌群組成亦存在一定的特異性。

2.2 人工窖泥樣品微生物群落結構組成分析

在對人工窖泥微生物菌群多樣性分析的基礎上，進一步對優質序列進行物種分類和注釋，在門和屬水平上共注釋到14個細菌門和343個細菌屬，13個真菌門和106個真菌屬。將平均相對豐度＞1.0%的菌門或屬定義為優勢菌門或優勢菌屬，將其他已知但平均相對豐度＜1.0%的門或屬歸類為“others”，將未知物種歸類為“unclassified”。基于門水平，人工窖泥樣品中細菌和真菌菌群的結構組成見圖3。

圖3 基于門水平人工窖泥樣品中細菌（a）和真菌（b）菌群結構Fig.3 Structure of bacterial (a) and fungal (b) communities in artificial pit mud samples based on phylum level

由圖3a可知，在注釋到的14個細菌門中，厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）的平均相對豐度分別為70.69%、22.41%和3.04%，是人工窖泥樣品中的優勢細菌門。LIANG H等[15]運用PCR-變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術分析發現，Firmicutes、Actinobacteria和Proteobacteria在老窖泥和新窖泥兩種類型的窖泥中占優勢，與本研究的結果較為相似，說明在細菌門水平上，人工窖泥和正常窖泥的細菌群落結構有一定的相似性。由圖3b可知，在注釋到的35個真菌門中，子囊菌門（Ascomycota）（89.60%）、毛霉菌門（Mucoromycota）（3.52%）和擔子菌門（Basidiomycota）（3.48%）是人工窖泥樣品中的優勢真菌門。LIU Y等[16]利用高通量測序技術對陶融型白酒上、中、下和底層窖泥的微生群落結構進行解析，發現Ascomycota、Mucoromycota和Basidiomycota是上、中、下和底層窖泥的優勢真菌門，亦與本研究結果一致。由圖3亦可知，各樣品間細菌、真菌門水平組成相似但相對豐度不同，如放線菌門在各樣品中的相對豐度分別為23.64%、21.06%和22.55%；毛霉菌門在各樣品中的相對豐度分別為2.85%、3.39%和4.35%。

基于屬水平，進一步對人工窖泥中微生物群落結構組成進行分析，結果見圖4。

圖4 基于屬水平人工窖泥樣品中細菌（a）和真菌（b）菌群結構Fig.4 Structure of bacterial (a) and fungal (b) communities in artificial pit mud samples based on genus level

由圖4a可知，在細菌屬水平上，優勢細菌屬有13個，包括魏斯氏菌屬（Weissella）（14.32%）、真桿菌屬（Eubacterium）（11.89%）、新斯氏菌屬（Neoscardovia）（9.42%）、片球菌屬（Pediococcus）（5.49%）、芽孢桿菌屬（Bacillus）（4.22%）、Caproicibacter（3.18%）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）（2.02%）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）（1.71%）、真絲菌屬（Planifilum）（1.65%）、狹義梭菌屬（Clostridium sensu stricto）（1.57%）、腸球菌屬（Enterococcus）（1.49%）、鏈霉菌屬（Streptomyces）（1.08%）和聯合乳桿菌屬（Ligilactobacillus）（1.02%）。其中魏斯氏菌屬、片球菌屬和芽孢桿菌屬均屬于乳酸菌，其產生的乳酸與乙醇反應可以生成白酒中重要的風味成分乳酸乙酯[17]；高溫放線菌屬是大曲中產淀粉酶、果膠酶和纖維素酶等水解酶類的重要來源，對大曲內部結構的疏松和大曲骨架的維持有重要作用[18]；狹義梭菌屬是一類厭氧菌，能利用乙酸和乙醇等生成白酒中重要的香味成分己酸乙酯和丁酸乙酯[19]；真桿菌屬中部分菌種的發酵代謝產物為丁酸、乙酸或甲酸，這些菌屬均是釀酒過程中重要的釀酒功能菌屬[20]。由圖4b可知，在真菌屬水平上，優勢真菌屬有6個，包括耐干霉菌屬（Xeromyces）（65.04%）、曲霉屬（Aspergillus）（9.57%）、節擔菌屬（Wallemia）（2.71%）、Trichomonascus（2.18%）、根霉屬（Rhizopus）（2.04%）和畢赤酵母屬（Pichia）（1.07%）。其中耐干霉菌屬、曲霉屬和根霉屬等菌屬具有較強的分泌糖化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶和蛋白酶等酶類的能力，進而促進酵母菌繁殖，產生更多的乙醇，提升白酒的風味和品質[21]；畢赤酵母屬是酵母菌的一類，可以將甲醇作為碳源生成乙醇[22]。

由圖4亦可知，在細菌和真菌屬水平上，未知物種的平均相對豐度分別為22.82%和11.05%，在人工窖泥樣品中占比較大。綜上所述，人工窖泥樣品中不僅含有多種重要的釀酒功能菌屬，還有較多的未知物種，這對人工窖泥微生物菌庫的擴充有著重要的意義。

2.3 人工窖泥樣品優勢菌屬間的相關性分析

人工窖泥樣品中微生物菌群組成較為豐富，且各樣品細菌和真菌菌群存在一定的相似性和特異性，而高質量人工窖泥形成的重要因素之一是微生物菌群的共同作用。為進一步探究人工窖泥樣品中微生物菌群間的關系，對人工窖泥樣品中優勢菌屬間的相關性進行分析，結果見圖5。

圖5 人工窖泥樣品中優勢菌屬間相關性分析熱圖Fig.5 Heat map of correlation analysis between dominant microbial genera in artificial pit mud samples

由圖5可知，真絲菌屬（Planifilum）與芽孢桿菌屬（Bacillus）呈顯著正相關（P＜0.05），聯合乳桿菌屬（Ligilactobacillus）與腸球菌屬（Enterococcus）呈顯著正相關（P＜0.05）。其中，芽孢桿菌屬參與了白酒釀造全過程，其代謝產生的蛋白酶、淀粉酶等水解酶類可以將原料分解成各種風味化合物的前體物質[23]；而聯合乳桿菌屬（Ligilactobacillus）和腸球菌屬（Enterococcus）屬于乳酸菌，在一定條件下，其部分菌種產生的酸類物質與風味物質結合會生成白酒的主體香型物質乳酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯等[24]。由此可知，不同細菌類群間的協同效應賦予了白酒獨特的酒體風味。此外，人工窖泥樣品中部分優勢菌屬間存在拮抗或競爭關系，如曲霉屬（Aspergillus）與腸球菌屬（Enterococcus）呈極顯著負相關（P＜0.01）；魏斯氏菌屬（Weissella）與高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）及畢赤酵母屬（Pichia）呈顯著負相關（P＜0.05），真絲菌屬（Planifilum）與真桿菌屬（Eubacterium）呈顯著負相關（P＜0.05），棒狀桿菌屬（Corynebacterium）與新斯氏菌屬（Neoscardovia）呈顯著負相關（P＜0.05），聯合乳桿菌屬（Ligilactobacillus）與狹義梭菌屬（Clostridium sensu stricto）及曲霉屬（Aspergillus）呈顯著負相關（P＜0.05）。曲霉屬為白酒釀制提供了種類繁多的酶類，如糖化酶、蛋白酶、液化酶和脂肪酶等酶類[21]；畢赤酵母屬產酯能力強，能以有機酸為原料合成酯類，對白酒出酒率、風味和品質都有一定的影響[25]；魏斯氏菌屬和真桿菌屬可以產生乳酸、丁酸、乙酸或甲酸等有機酸，其在人工窖泥樣品中的相對豐度分別為14.32%和11.89%，可能是白酒滋味品質形成的重要來源[26-27]；而真絲菌屬是窖泥老化或者質量較差窖泥中所含有的指示菌屬，其在人工窖泥樣品中的平均相對豐度為1.65%，如果此菌屬含量過高，會影響人工窖泥的品質[28]。因此，在后續對人工窖泥的研究中，可以采用傳統純培養技術收集魏斯氏菌屬、腸球菌屬、畢赤酵母屬和曲霉屬等釀酒菌屬的部分性狀優良菌種，選擇性的應用到人工窖泥品質提升中。

3 結論

納入本研究的人工窖泥樣品中，微生物菌群組成較為豐富且存在一定的特異性，通過高通量測序技術從中共注釋到13個優勢細菌屬和6個優勢真菌屬，優勢細菌屬分別為Weissella、Eubacterium、Neoscardovia、Pediococcus、Bacillus、Caproicibacter、Thermoactinomyces、Corynebacterium、Planifilum、Clostridium sensu stricto、Enterococcus、Streptomyces和Ligilactobacillus，優勢真菌屬分別為Xeromyces、Aspergillus、Wallemia、Trichomonascus、Rhizopus和Pichia。優勢菌屬間的相關性分析表明，芽孢桿菌屬（Bacillus）、聯合乳桿菌屬（Ligilactobacillus）和腸球菌屬（Enterococcus）等菌屬對人工窖泥品質的調節有積極的正向協同效應，而部分細菌屬與真菌屬之間存在一定的拮抗或競爭關系。在后續研究中可對人工窖泥中未知物種進行深入探究，還可以采用傳統純培養技術對釀酒功能菌屬進行分離鑒定，依據各菌屬間的相關性適時添加合適菌株調節窖泥微生態。