花期糯紅高粱內生酵母分離鑒定及功能菌篩選

胡連清，劉雯雯，陳 露，周萬海*，馮瑞章，魏 琴，趙 鑫，唐馨宇，張玉婷

（1.宜賓學院 農林與食品工程學部，四川 宜賓 644000；2.香料植物資源開發與利用四川省高校重點實驗室，四川 宜賓 644000）

宜賓釀酒專用糯紅高粱為國家地理標志的保護農產品[1-2]。糯紅高粱的熟期短，淀粉結構相對疏松，富含有較大部分未完全轉化的中間物質，且蛋白、脂肪和單寧含量適中，適于酵母等發酵微生物生長，作為釀酒原料其在釀酒過程中表現出易糊化、易發酵的優勢[3-4]，是釀造優質白酒的主要原料之一[2]。關于糯紅高粱內生酵母菌株應用于發酵行業的報道鮮見，糯紅高粱中的內生酵母菌種類豐富，但在各行業中的開發率以及利用率則較低，因此研究糯紅高粱內生酵母菌的種類、內生酵母菌株的發酵性能，為后續將其應用于發酵行業具有重要意義。

植物內生菌是指能夠在健康的植物組織中定殖與植物和諧共生卻又不產生明顯癥狀的微生物共生體[5-6]。植物內生酵母為植物內生菌中的一個大類，其生命周期的一部分時間內定殖于健康植物組織中，且不會對寄主植物造成損害，它與寄主在長期進化過程中形成了相互依存、互惠互利的共生關系[7-8]。植物內生酵母可在生長過程中產生的一些植物激素與其他因子促進寄主植物的生長，并維持寄主植物的健康，其擅長利用植物的己糖和戊糖，并且植物內生酵母對植物化學物質的耐受性更強[9]。一些研究者將分離出的植物內生酵母應用于食品發酵行業，如從無花果[10]、葡萄[11]、枸杞[12]和桑葚[13]等果實中分離出可以用于釀酒的內生酵母菌株。普通的釀酒酵母菌僅能發酵六碳糖，而不能發酵由五碳糖組成的木質纖維素，而BURA R等[14]從楊樹中分離的紅酵母皆能發酵五碳糖木糖和六碳糖葡萄糖，因此其在該方面植物內生酵母優于工業酵母菌株。以往有關植物內生菌中的內生酵母的研究較少，大都多集中在對多年生木本植物的研究上，且分離出的植物內生酵母極少[15]；對糯紅高粱的研究也多集中在分類、種質資源收集評價、品種選育和栽培管理技術方面，而對其內生酵母的研究則鮮見，尤其是品種、器官組織對其菌群結構和多樣性的影響。

本研究以宜賓地區釀酒專用的糯紅高粱為試驗材料，分析花期糯紅高粱不同品種的不同組織中內生酵母多樣性，并通過選擇培養基篩選功能酵母，以揭示花期糯紅高粱內生酵母多樣性及群落結構變化規律，為更深入探究功能內生酵母在宿主生長發育上起何種作用提供基礎支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料糯紅高粱（雜交種金糯粱1號、地方品種青殼洋）：宜賓市翠屏區農牧局農技推廣中心。

1.1.2 試劑

Goldview I型核酸染色劑、2×Taq聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、脫氧核糖核酸（deoxyribo nucleic acid，DNA）Maker、GoldView、Lysis Buffer Direct PCR裂解液：大連寶生物有限公司；引物NL1、NL2：由上海生工生物有限公司合成。

1.1.3 培養基

分離培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基、酵母膏胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dextrose agar，YEPD）培養基、酵母麥芽瓊脂（yeast malt agar，YM）培養基；鑒定培養基為WL營養瓊脂；選擇培養基為淀粉瓊脂培養基、脫脂乳培養基、三丁酸甘油酯瓊脂培養基、果膠瓊脂培養基、吐溫-80瓊脂培養基：成都新界實驗器材有限公司。

1.2 儀器與設備

JJ060387超凈工作臺：吳江市凈化設備總廠；LDZX-75KBS高溫蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；DHG-9620A電熱恒溫鼓風干燥箱、LRH-70恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；UPT-Ⅰ-50優普超純取水機：成都市超純科技有限公司；HH-6恒溫水浴鍋、DYCR-8C恒溫振蕩器：上海高致精密儀器有限公司；Ks48+PCR儀：冠森生物科技（上海）有限公司；JS-2000凝膠電泳儀：上海培清科技有限公司；AR2130電子分析天平：德國賽多利斯集團。

1.3 方法

1.3.1 糯紅高粱內生酵母的分離與保藏

表面消毒處理參考劉曉靜等[16]的方法并進行一定的優化，糯紅高粱各組織表面消毒的具體操作方法如下：根部按流水沖洗60 min，無菌水洗滌2次，體積分數75%無菌乙醇處理1 min，無菌水洗滌1次，5%NaClO處理3 min，體積分數75%無菌乙醇處理1 min；莖部按流水沖洗60 min，無菌水洗滌2次，體積分數75%無菌乙醇處理0.5 min，無菌水洗滌1次，4%NaClO處理4 min，體積分數75%無菌乙醇處理20 s；葉和花部按流水沖洗60 min，無菌水洗滌2次，體積分數75%無菌乙醇處理20 s，無菌水洗滌1次，3%NaClO處理3 min，體積分數75%無菌乙醇處理20 s，最后用無菌水沖洗3次完成表面無菌化處理。參照胡連清等[17]的方法用滅菌剪刀根據器官組織形狀特點切割成小塊，分別接種至PDA、YEPD和YM種分離培養基上，并將最后一次無菌水洗滌液涂布于相同培養基上作為空白對照，以檢驗消毒效果，然后將接種后的平板置于25 ℃恒溫培養箱中培養3～5 d，當組織塊傷口出現菌落時，及時用接種環挑取菌落，連續劃線獲得純化菌株，最后進行YPD培養基的斜面和甘油管保藏。

1.3.2 糯紅高粱內生酵母分類鑒定方法

將分離獲得的菌株劃線接種于WL培養基[18-19]，25 ℃培養3 d，觀察單菌落的形態特征。同時，在顯微鏡下觀察酵母的細胞形態以此對分離到的酵母菌株進行初步的形態分類。從上述平板培養基上挑取單菌落酵母菌體，加入Lysis Buffer Direct PCR裂解液，水浴15 min后離心，取上清液直接用通用引物NL1和NL2對26S rDNA D1/D2區進行PCR擴增。PCR擴增體系：5 μL DNA模板、1 μL NL1（10 mmol/L）、1μLNL2（10 mmol/L）、25 μL 2×TaqPCR Master Mix、18 μL ddH2O；PCR擴增程序：94℃預變性4min，94℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，32個循環，72 ℃再延伸10 min[20]。PCR擴增目標產物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送上海生工測序。用美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）網站基于局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）程序進行序列比對。

1.3.3 酵母菌多樣性指數和相似性指數計算

量化的多樣性指數可反映植物生長過程中內生菌群落結構的演替變化規律[21]。根據鑒定的糯紅高粱內生酵母菌和各測度指數的特點，應用生態學評價方法[22]，計算不同組織中內生酵母的豐富度數、香農指數、均勻度指數和優勢度指數。

1.3.4 糯紅高粱內生酵母功能菌鑒定

將1.3.1中純化得到的菌分別接種至淀粉瓊脂培養基、脫脂乳培養基、三丁酸甘油酯瓊脂培養基、果膠瓊脂培養基以及吐溫-80瓊脂培養基等選擇培養基上，置于28 ℃恒溫培養箱中培養3～5 d，觀察有無光（暈）圈產生，進而判斷菌株的產酶功能。

1.3.5 糯紅高粱內生酵母菌生化鑒定

采用杭州濱和微生物試劑有限公司生產的TH-15C生化管對分離得到的內生酵母菌進行生化鑒定。將分離純化的內生酵母菌接種至YEPD液體培養基中，30 ℃條件下培養72 h，離心收集菌體，然后用0.85%的NaCl溶液稀釋制備成0.5麥氏濁度的菌懸液，吸取10 μL菌懸液加至不同的酵母樣真菌糖生化鑒定管中，同時做無糖陰性對照，在30 ℃條件下培養48～72 h，在電子放大鏡下觀察記錄加入菌液渾濁程度的變化，判斷分離內生酵母對不同糖的利用能力。

2 結果與分析

2.1 花期糯紅高粱內生酵母菌的分離

采用傳統的平板分離法，從2個糯紅高粱花期的根、莖、葉和花組織中共分離到54株內生酵母，其中從根中分離到10株，占分離總數的18.51%；莖中分離到28株，占分離總數的51.85%；葉中分離得到7株，占分離總數的12.96%，花中分離得到9株，占分離總數的16.68%。

2.2 糯紅高粱內生酵母形態

將上述分離的酵母菌劃線接種至用WL營養瓊脂培養基，根據菌落的顏色和形態將其聚類，結果見表1。由表1可知，分離的54株酵母共分為8種形態類型，菌落顏色有淺綠色、淡藍色、乳白色、淡綠色、墨綠色、淺粉色、奶油色等，菌落質地有光滑、粘稠，菌落有的平伏，有的中間隆起，表面有的光滑反光，有的光滑黯淡，菌落邊緣形態各異。

表1 糯紅高粱花期內生酵母菌的形態Table 1 Morphology of endophytic yeasts in waxy sorghum at flowering stage

2.3 糯紅高粱內生酵母菌組成

從糯紅高粱花期的根、莖、葉和花4個組織中分別分離出10、28、7、9株內生酵母菌（表2），對分離得到的該54株酵母通過26S rDNA D1/D2區基因序列測序鑒定為12個屬17個種，分別為貝氏酵母（Begerowomyces）、粘質皮狀新絲孢酵母（Cutaneotrichosporon）、隱球酵母（Cryptococcus）、鐮刀菌屬（Fusarium）、漢納酵母（Hannaella）、微曲酵母（Microbotryozyma）、莫氏黑粉菌（Moesziomyces）、金黃色蝶形擔孢酵母（Papiliotrema）、筑波擬酵母（Pseudozyma）、Symmetrospora、絲孢酵母菌（Trichosporon）與異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces），其中優勢屬為隱球酵母（Cryptococcus），占40.74%；優勢種為黃色隱球酵母（Cryptococcus luteolus），占35.17%。該結果表明糯紅高粱內生酵母種類豐富多樣。

表2 糯紅高粱花期內生酵母組成Table 2 Composition of endophytic yeasts in waxy sorghum at flowering stage

糯紅高粱為釀造白酒的優質原料[2]，由此可推斷，從糯紅高粱中分離的內生酵母的生長性能以及發酵性能可能較為為優良。探索特定植物物種中內生酵母的多樣性，對了解它們在植物中的功能提供了基礎，而獲得可培養植物內生酵母是對其進行全基因組測序、定殖特點分析、理化性質測定及其與植物互作機制解析的前提[23]。目前，有關植物內生酵母的研究鮮見且多集中于多年生木本植物上；ZHAO J H等[24]從30棵北京油松松枝中分離得到3株內生酵母；李亞輝等[25]從枸杞中分離得到6 株內生酵母菌；MIDDELHOVEN W J[26]從紅杉的嫩枝中分離得到4種酵母菌種，表明其內生酵母豐富多樣。

此外，從品種來分析，從金糯粱1號中分離得到41株內生酵母，鑒定為11屬14種；從青殼洋中分離得到13株，鑒定為6屬6種。該結果表明金糯粱1號的內生酵母多樣性優于地方品種青殼洋，這可能是由于金糯粱1號為雜交新品種的緣故，相關內容還需更進一步的分析。金糯粱1號金糯粱1號與青殼洋兩品中花期的優勢內生酵母不一致且都為特有菌，金糯粱1號優勢內生酵母為黃色隱球酵母（Cryptococcus luteolus），而青殼洋的優勢內生酵母為Papiliotrema flavescens，說明不同糯紅高粱品種的內生酵母菌組成存在一定的差異。該結果進一步表明糯紅高粱中內生酵母在各組織以及不同品種間可能具有不同的傳播機制。

2.4 糯紅高粱內生酵母菌的多樣性分析

由表3可知，莖內生酵母的豐富度指數表現為莖＞根＞花＞葉；糯紅高粱內生酵母的均勻度指數表現為根＞花＞葉＞莖，糯紅高粱內生酵母菌優質度指數表現為花＞根＞莖＞葉。該結果表明糯紅高粱根、莖、葉、花各部分的各項多樣性指數存在差異。

表3 花期糯紅高粱不同組織內生酵母菌多樣性指數Table 3 Diversity indexes of endophytic yeasts in different tissues of waxy sorghum at flowering stage

2.5 糯紅高粱內生酵母功能菌篩選

利用淀粉瓊脂培養基、脫脂乳培養基、三丁酸甘油酯瓊脂培養基、果膠瓊脂培養基、吐溫-80瓊脂培養基等選擇培養基對分離得到的54株內生酵母進行功能鑒定，結果見表4。由表4可知，篩選出的54株酵母中，其中29株內生酵母為功能酵母菌，FAJ28菌株的功能最為豐富，同時具有產淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、產酯酶與纖維素酶5種功能；產酯酶的菌株最多，包括FAJ30、FBR14、FBF20、HBF22、FAL13、FAJ9等15株；產纖維素酶的內生酵母菌較少，包括菌株FAL15、FAL17、FAJ18；另外結果還顯示，菌株FBJ15產淀粉酶能力最強，菌株FAF8產蛋白酶能力最強，菌株FAJ43產脂肪酶能力最強；菌株HBF22產酯酶能力最強。

表4 花期糯紅高粱功能內生酵母篩選Table 4 Screening of functional endophytic yeasts in waxy sorghum at flowering stage

植物內生酵母能產生植物激素以及分泌一些可作為生物催化劑和抗菌劑的生物化學品，這些分泌物植物生長方面也具有一定的促進作用，如VAZ A B M等[27]從西蘭花中分離得到3株具有抗菌活性的內生酵母；NASSAR A H等[28]從玉米中分離得到8株產生長素IAA和IPYA的內生酵母菌，并從楊樹中分離得到的內生酵母菌株WP1顯著促進了甜椒的生長，促使甜椒根與芽質量的增加，并促使甜椒提前開花與結實，同時顯著提高了果實的產量。本研究分離出的2株異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）FAL15與FAL17，經鑒定為功能菌，有研究顯示，異常威克漢姆酵母菌類在發酵行業應用廣泛，如制備低溫大曲[29]、釀造酒曲與醬油[30-31]、發酵面團[32]、制成凍干菌劑[33]等，除此之外，該菌類耐低溫[34]、產酯[35]、產香[36]、產尿素[37]且產風味物質能力強[38]。糯紅高粱又為釀造白酒的優質原料，因此推測從糯紅高粱分離得到的異常威克漢姆酵母菌可能適用于酒曲發酵和醬曲發酵等食品發酵行業，后續將會對FAL15與FAL17兩菌株的功能分析作更深入的研究。

2.6 糯紅高粱不同部位內生酵母菌生化鑒定結果

糯紅高粱不同部位內生酵母菌生化鑒定結果見表5。由表5可知，能夠利用甘露醇的有11株，其中FAJ31、FBJ17、FAJ30、FAJ43、FBR14、FAL13利用效果較好；能夠利用甘露醇的有16株，其中HBF22、FBJ17、FAJ41、FAJ30、FBR14、FBF20利用效果較好；能夠利用水楊素的有6株，分別為FAJ11、FAR1、FBF19、FAJ31、FBJ17、FBR14；能夠利用鼠李糖的有12株，其中HBF22、FAJ31、FBJ17、FBR14、FBF20、FAL13利用效果較好；能夠利用葡萄糖的有12株，其中FBJ17、FBR14利用效果較好；能夠利用蔗糖的有12株，其中FBJ17、FBR14利用效果較好；能夠利用木糖醇的有15株，其中HBF22、FAJ31、FAJ41、FAJ43、FBJ17、FBR14利用效果較好；能夠利用松三糖的有12株，其中FAJ31、FBJ17、FBF20利用效果較好；能夠利用蕈糖的有10株，其中FAJ31、FBJ17、FBR14利用效果較好；能夠利用麥芽糖的有13株，其中HBF22、FBJ17、FBR14利用效果較好；能夠利用阿糖的有13株，其中FBJ17、FBR14利用效果較好；能夠利用衛矛糖的有12株，其中HBF22、FAJ31、FBJ17、FAJ43利用效果較好；能夠利用棉子糖的有13株，其中FAJ31、FBJ17、FAJ30、FBJ16利用效果較好；能夠利用肌醇的有13株，其中FAJ31、FBJ17利用效果較好；能夠利用N-乙酰葡胺的有13株，其中FAJ31、FAJ43、FBJ17、FBR14利用效果較好；能夠利用乳糖的有8株，其中FAJ31、FBJ17、FBR14利用效果較好；能夠利用纖維二糖的有13株，其中FBJ17、FBR14利用效果較好；能夠利用半乳糖的有13株，其中FAJ31、FBJ17、FBR14利用效果較好；能夠利用山梨醇的有12株，其中FAJ31、FBJ17、FAJ43利用效果較好；能夠利用木梨糖的有16株，其中FAJ31、FAJ41、FAJ30、FBJ17、FBR14、FBF20利用效果較好。由此可見，糯紅高粱中的內生酵母在其生長發育過程中發揮著重要作用，相關內容值得進一步的研究。

表5 花期糯紅高粱內生酵母菌碳源同化實驗結果Table 5 Experimental results of carbon source assimilation of endophytic yeasts in waxy sorghum at flowering stage

3 結論

糯紅高粱花期內生酵母種類組成豐富且功能多樣，從糯紅高粱根、莖、葉和花組織中分離得到54株可培養的內生酵母菌菌株，鑒定為12個屬17個種，分別為貝氏酵母（Begerowomyces）、粘質皮狀新絲孢酵母（Cutaneotrichosporon）、隱球酵母（Cryptococcus）、鐮刀菌屬（Fusarium）、漢納酵母（Hannaella）、微曲酵母（Microbotryozyma）、莫氏黑粉菌（Moesziomyces）、金黃色蝶形擔孢酵母（Papiliotrema）、筑波擬酵母（Pseudozyma）、Symmetrospora、絲孢酵母菌（Trichosporon）與異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces），其中優勢屬為隱球酵母（Cryptococcus），優勢種為黃色隱球酵母（Cryptococcus luteolus）。糯紅高粱根、莖、葉、花各組織中的內生酵母各項多樣性指數均有明顯差異，其豐富度指數表現為莖＞根＞花＞葉；均勻度指數表現為根＞花＞葉＞莖；優勢度指數表現為花＞根＞莖＞葉。通過選擇培養基篩選出29株功能酵母菌，其中菌株FAJ28的功能最為豐富，產酯酶的菌株最多，產纖維素酶的內生酵母菌最少；另研究結果還顯示，菌株FBJ15產淀粉酶能力最強，菌株FAF8產蛋白酶能力最強，菌株FAJ43產脂肪酶能力最強；菌株HBF22產酯酶能力最強。糯紅高粱花期內生酵母菌生化功能豐富，對山梨糖、甘露醇等有一定的利用作用。