自然發(fā)酵獼猴桃果酒中降蘋果酸酵母的篩選與鑒定

周清麗，周紹琴，周 艷*

（貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與健康學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

果酒是將新鮮水果或果汁全部或部分發(fā)酵制成酒精度在8%vol～12%vol之間的發(fā)酵酒[1]。近年來，低醇果酒（酒精度＜7%vol）備受年輕消費者青睞，不僅含有豐富的生物活性成分，還能降低酒精的危害，低醇果酒現(xiàn)已逐漸延伸水果產(chǎn)業(yè)鏈，以此產(chǎn)品形式提升產(chǎn)業(yè)效益[2]。根據(jù)中研普華研究院報告《2022-2026年中國果酒行業(yè)發(fā)展態(tài)勢與前景展望研究報告》統(tǒng)計分析顯示，目前，我國果酒銷售額的年增長率為15%，市場前景廣闊。

然而，果酒存在酸度過高的現(xiàn)象，這也是制約果酒發(fā)展的重要因素[3]。適當(dāng)?shù)墓扑岫饶芴嵘频目诟衃4]，而酸度過高則會使酒體風(fēng)味變得酸澀[5]。果酒酸度主要與果酒中有機酸的組成及其含量有關(guān)[6]，果酒中的有機酸的來源主要包括水果中本身含有的有機酸，比如檸檬酸、蘋果酸和酒石酸等，以及在發(fā)酵過程中可能產(chǎn)生有機酸，如醋酸、乳酸[7]。不同的有機酸賦予果酒不同的口感，如蘋果酸含量過多會導(dǎo)致果酒口感酸澀，檸檬酸的酸味溫和清爽，可以賦予果酒適宜的酸感[8]。蘋果酸是果酒中常見的有機酸，葡萄酒中蘋果酸和酒石酸的含量可以占到葡萄酒總酸度的70%～90%，當(dāng)蘋果酸含量較多時，會導(dǎo)致水蜜桃果酒口感粗糙[9]，同時這也是引起蘋果酒酸味高、苦澀感強的的主要原因[10]。降低果酒中蘋果酸的含量能提升果酒的口感，有利于擴大果酒的市場規(guī)模。

目前，果酒中常見的降酸方法包括化學(xué)法、物理法和生物法三種[11]。其中，生物降酸是利用微生物的生長代謝分解有機酸，與物理降酸和化學(xué)降酸相比，其具有條件綠色、反應(yīng)溫和、食用安全性高等優(yōu)點[12]，受到廣泛關(guān)注，其中應(yīng)用具有降酸能力的酵母成為降低果酒酸度的一種重要手段。劉延嶺等[13]從獼猴桃果園篩選出具有蘋果酸降解能力的3株酵母菌株，對蘋果酸的降解率分別為28.36%、25.92%和25.68%。經(jīng)鑒定，其中兩株是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），一株是畢赤酵母（Pichia pastoris）。文連奎等[14]以檸檬酸和蘋果酸作為唯一碳源，從葡萄園土壤中篩選得到1株可以降解蘋果酸和檸檬酸的酵母菌，經(jīng)鑒定為陸生伊薩酵母（Issatchenkia terricola）。唐瑩等[15]研究發(fā)現(xiàn)，陸生伊薩酵母菌WJL-G4具有降解檸檬酸的功能，最大降酸率達到90%。STEYN A等[16]從蘋果、葡萄和李子廢料中篩選出一株具有較好的降解蘋果酸能力的酵母菌，經(jīng)鑒定為釀酒酵母。不同菌株對蘋果酸的降解能力具有差異，REDZEPOVIC S等[17]對來自3個釀酒酵母菌株的蘋果酸酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進行了初步研究，闡明酵母的蘋果酸酶可能在對不同生理條件做出反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。

本研究以實驗前期篩選出的7株低醇酵母（編號為YK1～YK7）為研究對象，通過測定pH值、總酸含量及蘋果酸含量，探討其對蘋果酸的降解能力，并通過形態(tài)觀察、生理生化試驗和分子生物學(xué)技術(shù)對篩選菌株進行鑒定，對開發(fā)低醇低酸度獼猴桃果酒提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

酵母 菌 株YK1、YK2、YK3、YK4、YK5、YK6 和YK7：均分離自獼猴桃自然發(fā)酵液中，保藏于本實驗室；新鮮獼猴桃：貴州修文。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dextrose agar，YPD）培養(yǎng)基：杭州百思生物技術(shù)有限公司。

YPD-蘋果酸液體培養(yǎng)基[7]：YPD液體培養(yǎng)基中添加10 g/L蘋果酸，pH值為3.33，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 試劑

L-蘋果酸（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二銨（分析純）、甲醇（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉（分析純）：重慶江川化工（集團）有限公司；硫酸銨、氯化鈉、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、尿素、硝酸銨（均為分析純）：天津市致遠化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1510型酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；LT1002C型電子天平：常熟市天量儀器有限責(zé)任公司；TG16-WS臺式高速離心機：常州朗越儀器制造有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；LNB96G型基因擴增儀：上海皓莊儀器有限公司；7890B氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、G1311B液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：安捷倫科技新加坡（國際）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同酵母菌對蘋果酸降解能力的比較分析

將7株酵母菌株接種至YPD-蘋果酸液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)11 d后，8 000 r/min離心10 min后取上清，測定上清液中的pH值及總酸含量，并計算降酸率，以不接菌的YPD-蘋果酸液體培養(yǎng)基為空白，比較不同酵母菌株對酸的降解能力。

1.3.2 獼猴桃果酒的發(fā)酵工藝流程及操作要點

獼猴桃→去皮、打漿→加入SO2及果膠酶→水浴→調(diào)糖度→灌裝→發(fā)酵→離心→獼猴桃果酒成品

操作要點：

參考李加興等[18]的方法并稍作修改，挑選成熟且新鮮的獼猴桃，將其去皮、打漿，并向其中加入質(zhì)量濃度為90 mg/L的SO2及100 mg/L的果膠酶，分裝于發(fā)酵罐中，用保鮮膜密封好，置于55 ℃水浴鍋中2 h，用白糖將其糖度調(diào)至22°Bx，灌裝后接種2%（V/V）的酵母菌株種子液（活菌數(shù)為1×108CFU/mL），密封好于培養(yǎng)箱28 ℃恒溫發(fā)酵11 d，離心（4 500 r/min，10 min）后即得到成品。

1.3.3 分析檢測

pH值的測定：采用PHS-3CpH計測定pH值。

總酸含量的測定：采用酸堿指示劑滴定法[19]，并計算總降酸率，其計算公式如下：

式中：A0為空白總酸含量，g/L；A1為樣品總酸含量，g/L。

酒精度的測定：參考國標(biāo)GB 5009.225—2023《酒中乙醇濃度的測定》[20]采用氣相色譜儀進行測定并稍作修改。吸取適量離心過后的酒樣上清液，過0.22 μm水相濾膜裝入進樣瓶。GC條件為前進樣口溫度230 ℃，前檢測器溫度280 ℃，空氣流速380 mL/min，氫氣流速30 mL/min，尾氣流速30 mL/min，柱溫46 ℃，升溫程序為以5 ℃/min升至50 ℃，保持5 min，再以20 ℃/min升至230 ℃，保持2 min。

蘋果酸含量的測定：采用高效液相色譜法[21]，并計算蘋果酸的降酸率，其計算公式如下：

式中：A0為空白蘋果酸含量，g/L，A1為樣品蘋果酸酸含量，g/L。

1.3.4 菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：將篩選菌株劃線接種于YPD培養(yǎng)基，28 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h，挑取單菌落進行純化，觀察菌落顏色、形態(tài)、邊緣、表面等菌落特征，并通過顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

生理生化實驗：參考文獻[22-23]對菌株的碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖）、氮源（蛋白胨、蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、尿素）利用能力進行分析。

分子生物學(xué)鑒定：提取篩選菌株的總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其為模板，采用通用引物內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（internal transcribed spacer 1，ITS1）及ITS4進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR擴增體系：Mix 12.5 μL，模板DNA 4 μL，ITS1 1 μL，ITS4 1 μL，雙蒸水（ddH2O）6.5 μL。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、52 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸8 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測、純化，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性比對，選取同源性較高的模式菌株的ITS基因序列，采用MEGA7軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)分析均使用Origin2023和SPSS26進行，每個樣品做3個平行，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母菌株對蘋果酸降解能力的比較分析

劉延嶺等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在蘋果酸質(zhì)量濃度為0～10 g/L范圍內(nèi)，釀酒酵母PJ34、ZJ22和畢赤酵母ZG13對酸的耐受性隨著蘋果酸質(zhì)量濃度的增大而下降，但均能正常生長。因此，選擇蘋果酸質(zhì)量濃度為10 g/L的YPD液體培養(yǎng)基進行菌株的篩選。7株酵母菌在YPD-蘋果酸液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，pH值和總酸含量及總降酸率見圖1。

圖1 不同酵母菌株蘋果酸降解效果的比較Fig.1 Comparison of malic acid reduction effect of different yeast strains

由圖1可知，YPD-蘋果酸液體培養(yǎng)基經(jīng)不同酵母菌培養(yǎng)后，pH值上升，總酸含量降低。其中接種菌株YK2的YPD-蘋果酸液體培養(yǎng)基pH值最高，為3.94，總酸含量最低，為5.74 g/L，其總降酸率為48.75%；其次是菌株YK5，pH為3.91，總酸含量為5.92 g/L，總降酸率為47.09%；菌株YK4和YK7的總降酸率較低，僅為15.79%、13.57%，低于文獻[7]中菌株GS1-18的總酸降解率27.18%，因此，選擇總降酸率較高的菌株YK1、YK2、YK3、YK5及YK6進行進一步研究。

2.2 不同酵母菌株發(fā)酵對獼猴桃果酒的影響

2.2.1 對酒精度的影響

酒精度是果酒的重要指標(biāo)，不同酵母菌株發(fā)酵對獼猴桃果酒酒精度的影響見圖2。

圖2 不同酵母菌株發(fā)酵對獼猴桃果酒酒精度的影響Fig.2 Effect of different yeast strains on the alcohol content of kiwifruit wine

由圖2可知，5株酵母菌株發(fā)酵獼猴桃果酒的酒精度為2.0%vol～3.1%vol，酒精度均低于7%vol[24]，說明這幾株菌株均為低產(chǎn)醇酵母。其中菌株YK3發(fā)酵獼猴挑果酒的酒精度最高，為3.1%vol，菌株YK5發(fā)酵獼猴挑果酒的酒精度最低，為2.0%vol。

2.2.2 對pH值、總酸及蘋果酸的影響

對獼猴桃果酒的pH值、總酸含量和蘋果酸含量進行測定，并計算總降酸率和蘋果酸降酸率，結(jié)果見表1。

表1 不同酵母菌株對獼猴桃果酒pH值、總酸及蘋果酸含量的影響Table 1 Effects of different yeast strains on pH, total acid and malic acid content of kiwifruit wine

由表1可知，不同酵母菌株發(fā)酵的獼猴桃果酒的pH值均高于獼猴桃鮮汁，但僅菌株YK6發(fā)酵的獼猴桃果酒pH值升高顯著（P＜0.05），為3.66。pH值的升高預(yù)示著總酸含量下降，獼猴桃果汁經(jīng)酵母發(fā)酵后，總酸含量下降，為10.52～12.03 g/L，且除菌株YK5外，均下降顯著（P＜0.05）。其中，菌株YK2發(fā)酵獼猴桃果酒的總酸含量下降幅度最大，總降酸率達到15.67%，其次為菌株YK6，總降酸率為15.20%。

由表1亦可知，獼猴桃果汁經(jīng)酵母發(fā)酵后，蘋果酸含量均顯著下降（P＜0.05），為3.40～3.76 g/L，說明5株酵母菌株對蘋果酸均具有一定的蘋果酸降解能力。其中，菌株YK6的蘋果酸降酸率最高，為33.02%，其次為菌株YK3（29.98%）。由于菌株YK2和YK3發(fā)酵的獼猴桃果酒在總酸含量和蘋果酸含量上差異不顯著（P＞0.05），菌株YK2總降酸率高于菌株YK3，但蘋果酸降酸率低于菌株YK3，分析原因可能是兩個菌株對獼猴桃中其他的酸降解有關(guān)。徐張宇等[25]研究發(fā)現(xiàn)，水蜜桃發(fā)酵過程中，釀酒酵母能將水蜜桃原料中的蘋果酸降解10%左右。本研究的5株菌株蘋果酸降酸率均高于10%。綜上，菌株YK6對獼猴桃果酒的降酸效果最好。

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察5株酵母菌株的菌落及細胞形態(tài)見圖3。

圖3 5株酵母菌株的菌落（a）及細胞（b）形態(tài)Fig.3 Colony (a) and cell (b) morphology of 5 yeast strains

由圖3a可知，5株菌株的菌落均呈圓形，表面光滑，菌落突起，顏色呈淡黃色。由圖3b可知，菌株YK1、YK2及YK3的細胞呈圓形或卵圓形，均以出芽方式進行無性生殖；菌株YK5的細胞呈圓形，未觀察到其生殖方式，菌株YK6的細胞呈橢圓形，細胞較小，未觀察到其生殖方式。

2.3.2 生理生化鑒定結(jié)果

5株酵母菌的生理生化實驗結(jié)果見表2。由表2可知，5株酵母菌株均不能利用乳糖，除菌株YK6不能利用半乳糖，其他菌株均能利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖和麥芽糖；5株酵母菌株均能利用蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨和尿素。參考《酵母菌的特征與鑒定手冊》[26]，初步鑒定這5株菌是酵母菌。

表2 5株酵母菌株對不同碳源及氮源的利用情況Table 2 Utilization of different carbon and nitrogen sources by 5 yeast strains

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定

基于ITS基因序列，5株酵母菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。由圖4可知，酵母菌YK1、YK2、YK5與YK6與異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）聚于一支，親緣關(guān)系最近，酵母菌YK3與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）聚于一支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)觀察及生理生化實驗結(jié)果，將菌株YK1、YK2、YK5與YK6鑒定為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），菌株YK3被鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。也有研究表明，裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、畢赤克魯維酵母（Pichia kluyver）、異常威克漢姆酵母等具有降酸能力[26]。

圖4 基于ITS基因序列5株酵母菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 5 yeast strains based on ITS gene sequences

3 結(jié)論

通過體外蘋果酸降解能力測定，從實驗室前期保藏的7株酵母菌中篩選出5株具有較明顯降解蘋果酸的菌株，分別為菌株YK1、YK2、YK3、YK5、YK6，總降酸率為32.45%～48.76%。將這5株酵母菌株應(yīng)用于獼猴桃果酒，發(fā)現(xiàn)蘋果酸含量均下降，蘋果酸降酸率為25.90%～33.02%。經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化實驗及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定，菌株YK1、YK2、YK5與YK6為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），菌株YK3為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。其中，降蘋果酸效果最好的菌株為YK6，其發(fā)酵制備的獼猴桃果酒pH為3.66，總酸含量為10.58 g/L，蘋果酸含量為3.40 g/L，酒精度為2.2%vol，說明該菌株可作為釀造低酸、低醇獼猴桃果酒的優(yōu)良酵母。