三類傳統發酵食品中蠟樣芽孢桿菌的污染狀況研究

冼佳露，李 理*

（華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州 510641）

傳統發酵食品大多以自然發酵為主，在長期發酵過程中引入了環境中的多種微生物，這些微生物菌群利用原料中的營養成分通過多種代謝途徑改變產品的品質，激發獨特風味[1]。但這些微生物復雜多變，隨環境條件改變而發生動態變化，產品可能存在致病菌污染問題。

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是一種食源性條件致病菌，通過產生腹瀉型或嘔吐型毒素影響人體健康[2-4]。目前研究表明，腐乳、豆醬等發酵食品中普遍存在蠟樣芽孢桿菌污染，其中腐乳的污染率較高，并有超出限量標準的報道，具有食品安全隱患[5-7]，但對于傳統發酵食品毛豆腐、辣椒醬和酸湯中是否有蠟樣芽孢桿菌污染尚鮮見報道。毛豆腐和腐乳的前期發酵工藝相近[8]，均是豆漿經自然發酵的酸漿水凝乳壓榨制成豆腐[9]，再接種毛霉[10]發酵而成。如果原料、環境中有蠟樣芽孢桿菌則可在發酵過程中大量繁殖而帶來污染風險。此外，雖然目前關于辣椒醬產品污染蠟樣芽孢桿菌的報道較少，但有報道表明新鮮辣椒、干辣椒、辣椒粉中存在蠟樣芽孢桿菌污染，且分離菌株大多攜帶腹瀉型毒力基因[11-13]。酸湯因發酵原料差異，分為白酸湯和紅酸湯兩種[14]。白酸湯的主要發酵基質為米湯，從成熟老酸湯中接種乳桿菌屬、明串珠菌屬、醋酸桿菌屬等微生物菌群[15-17]；而紅酸湯的主要發酵基質為糯米、番茄、辣椒，優勢菌群為乳桿菌屬、德克酵母屬、釀酒酵母屬和畢赤酵母屬等[18-19]。酸湯中的蠟樣芽孢桿菌污染問題少見報道。傳統發酵食品的蠟樣芽孢桿菌污染問題應當引起重視，不管是原料中攜帶蠟樣芽孢桿菌，還是發酵過程中環境引入蠟樣芽孢桿菌，都可能導致終產品的污染菌數超過安全限量，消費者攝入后容易引發食品安全問題。

國內外相關研究顯示，蠟樣芽孢桿菌污染多發生在淀粉類食物、豆類制品、肉類制品、乳制品等產品中[20]，對辣椒醬、酸湯、毛豆腐三類傳統發酵食品的關注度較低。因此，本研究針對這三類產品，探究其蠟樣芽孢桿菌污染狀況，研究樣品分離菌株的生理生化特征、毒力基因和多樣性，以期為傳統發酵食品的安全生產提供指導和控制依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

辣椒醬（瓶裝密封）（5個樣品編號分別為L、S、XP、J、XS）和酸湯（瓶裝密封）（4個樣品編號分別為MST、ST、YM、3Y）、毛豆腐（塑料盒裝）（7個樣品編號分別為HW、ML、BCT、LHZ、HA、HZ、HY）：市售，低溫保存；標準菌株蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）ATCC14579：廣東省微生物保藏中心。

1.1.2 試劑

革蘭氏染色液、堿性復紅（0.5%）：廣州環凱生物科技有限公司；硝酸鹽還原試劑盒、溶菌酶溶液（0.1%）：青島海博生物技術有限公司；過氧化氫溶液（30%）、甲醇（99%）：南京化學試劑有限公司；多粘菌素B硫酸鹽（6 000 IU）：瑞舒生物科技有限公司；核酸熒光定量染料（P7589）：美國Invitrogen公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Mix、Marker、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：廣州東盛生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂（mannitol yolk polymyxin agar，MYP）培養基、胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）培養基、營養瓊脂培養基、硫酸錳營養瓊脂培養基、血平板：廣州環凱生物科技有限公司；腦心浸液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）培養基、硝酸鹽肉湯培養基、酪蛋白瓊脂培養基：青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

POGSON-09X無菌均質機：南京普森儀器設備有限公司；SE-CJ-1FD超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養箱：上海申賢恒溫設備廠；MDF-86V340E醫用低溫冰箱：安徽中科都菱商用電器股份有限公司；XSP-BM-3CA顯微鏡：上海雷韻試驗儀器制造有限公司；TC-96/G/H（b）C基因擴增儀：杭州柏恒科技有限公司；DYCP-31E電泳儀：北京六一生物科技有限公司；BG-gdsAUTO（130）凝膠成像系統：北京百晶生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將采集的樣品使用滅菌研缽在無菌條件下研磨均勻，分裝后液氮速凍，于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.2 蠟樣芽孢桿菌的分離與計數

根據國標GB 4789.14—2014《食品安全國家標準食品微生物學檢驗蠟樣芽孢桿菌檢驗》方法測定樣品的污染菌數[21]。每個稀釋梯度平行3份。在MYP平板中挑取疑似菌落，在營養瓊脂平板劃線分離，重復操作4～5次，直至獲得單菌落。BHI液體培養后，取菌液于25%甘油條件下在-80 ℃冰箱中儲存備用。

1.3.3 分離菌株的生理生化鑒定

根據國標GB 4789.14—2014《食品安全國家標準——食品微生物學檢驗蠟樣芽孢桿菌檢驗》方法進行測定[21]。

1.3.4 分離菌株的毒力基因測定

根據參考文獻[22]方法，適當修改。采用PCR方法檢測7個腸毒素基因（hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、cytK）、1個潛在毒力基因（entFM）和2個嘔吐毒力基因（cesB、EM1）。以蠟樣芽孢桿菌ATCC14579為對照菌株，并設置空白對照。

采用DNA提取試劑盒提取分離菌株DNA。分別配制25 μL PCR擴增體系（①hbl、nhe、entFM：提取DNA 2 μL、10 μmol/L引物各1 μL、PCR mix酶10 μL、超純水11 μL；②cytK：提取DNA 2 μL、100 μmol/L引物各0.2 μL、PCR mix酶12.5 μL、超純水10.5 μL；③cesB、EM1：提取DNA 2 μL、10 μmol/L引物各2.5 μL、PCR mix酶12.5 μL、超純水5.5 μL）。根據引物條件（表1）進行PCR擴增。PCR擴增結束后，將PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以2 000 bp Marker條帶作為對照。

表1 蠟樣芽孢桿菌毒力基因測定的引物及測定條件Table 1 Primers and conditions for the determination of Bacillus cereus virulence genes

1.3.5 分離菌株的分型

分型采用隨機擴增多態性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術。根據參考文獻[23]方法，適當修改。DNA提取方法同1.3.4。配制25 μL體系（提取DNA 1 μL、引物各1 μL、PCR mix酶10 μL、超純水12 μL）。采用引物HLWL85（序列5'-ACAACTGCTC-3'）對細菌基因組DNA進行隨機擴增，PCR擴增條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min、34 ℃退火2 min、72 ℃延伸2 min，共45個循環；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增結束后，將PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，分離擴增片段。

1.3.6 數據處理

數據分析使用Excel 2019、Origin 2018等軟件。RAPD電泳條帶經NTedit 軟件識別轉化為0/1矩陣，采用NTSYS PC 2.1軟件計算遺傳距離，使用MRGA11軟件算術平均值未加權對組方法（UPGMA）繪圖。

2 結果與分析

2.1 辣椒醬、酸湯和毛豆腐中蠟樣芽孢桿菌的污染菌數

3類傳統發酵食品的污染狀況及菌株分離情況見表2。

表2 三類傳統發酵食品中蠟樣芽孢桿菌的污染狀況Table 2 Contamination status of Bacillus cereus in three types of traditional fermented food

由表2可知，5個辣椒醬樣品中蠟樣芽孢桿菌的檢出率為100%，污染菌數在15～460 MPN/g之間，污染菌數較低，與已有報道基本一致。向婧姝等[24]檢測了貴陽市的120個市售糟辣椒樣品，樣品中蠟樣芽孢桿菌的檢出率為55.00%，污染菌數在0～100 CFU/g之間。辣椒醬的生產工藝比較簡單，通常是將辣椒洗凈晾干后切碎，再按一定比例拌入食鹽及切碎的姜、蒜等，裝壇密封后進行1～2月的自然發酵而成。雖然辣椒醬的生產過程沒有滅菌工序，但原輔料中含有大量的辣椒素、大蒜素、姜辣素和肉桂酸等抑菌成分[25-27]，因此對蠟樣芽孢桿菌有較好的控制效果。

2個紅酸湯和2個白酸湯共4個樣品的分析結果顯示，酸湯中的蠟樣芽孢桿菌檢出率為100%，污染菌數在3.6～23 MPN/g之間，污染程度不高。酸湯主要來源于貴州凱里，根據原料不同，有紅酸湯、白酸湯兩種產品。白酸湯是由糯米經清洗、磨碎后，接種老酸湯，再裝壇密封進行自然發酵即為白酸湯而成[28]。紅酸湯則是紅辣椒、番茄、姜、糯米、木姜子等原料磨碎后放入壇中，再加入白酒、食用鹽等進行調味，密封后進行自然發酵，制成半成品，然后再經二次發酵而成熟[15]。通常酸湯在罐裝后會進行商業滅菌。酸湯中的優勢菌群為乳桿菌屬（Lactobacillus）、德克酵母屬（Dekkera）等菌群[29-30]，而芽孢桿菌屬僅占比1%～2%，豐度較低。表明蠟樣芽孢桿菌在酸湯樣品中并不是優勢菌，污染菌數較少。

7個毛豆腐樣品的分析結果顯示，毛豆腐中蠟樣芽孢桿菌污染的情況差異較大。其中，2個購買于夏季（氣溫28～30 ℃）的樣品污染菌數高達7 lg CFU/g，而另外5個購買于秋季（氣溫18～20 ℃）的樣品未檢出蠟樣芽孢桿菌。這可能與購買樣品期間的氣溫不同或商家運輸產品的方式有關。蠟樣芽孢桿菌的最適生長溫度為30 ℃，夏季的溫度更有利于其生長繁殖，而運輸途中如果溫度升高，也會加速菌株繁殖的速度。

為了獲得蠟樣芽孢桿菌更為詳細的信息，進一步從以上樣品的MYP平板上挑取了單菌落，經分離純化，獲得了94個分離菌株。其中，辣椒醬來源分離菌株39株、酸湯來源分離菌株35株、毛豆腐來源分離菌株20株。由于蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌同屬于蠟樣芽孢桿菌族（Bacillus cereus sensu lato），許多表型特征及16S基因序列的同源性較高[32]。因此，需要進一步通過生理生化特征鑒定來判斷菌株是否為蠟樣芽孢桿菌。

2.2 分離菌株的生理生化鑒定

以蠟樣芽孢桿菌ATCC14579為對照菌株，對三類樣品分離的94個菌株分別進行了12項生理生化鑒定，結果見圖1。

圖1 分離菌株的生理生化鑒定結果Fig.1 Physiological and biochemical identification results of isolated strains

由圖1可知，94個菌株均具有完全溶血環，呈β溶血性。其中，86個菌株顯示硝酸鹽還原反應呈陽性，93個菌株顯示VP反應呈陽性。說明大部分菌株具有硝酸鹽還原能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣等物質，且在糖代謝過程中能分解葡萄糖生成丙酮酸，與發酵豆制品中的蠟樣芽孢桿菌生理生化特性一致[5]。所有菌株均符合蠟樣芽孢桿菌的生理生化特征。

2.3 蠟樣芽孢桿菌分離菌株的毒力基因譜

蠟樣芽孢桿菌可產生腹瀉型或嘔吐型毒素。腸毒素hbl、腸毒素nhe、腸毒素entFM、細胞毒素cytK是引起腹瀉性疾病最主要的毒力因子，通過使細胞成孔作用引起疾病[2，4]。引起嘔吐疾病的毒素主要是環狀十二肽Cereulide，cesB與EM1是合成該毒素的相關基因，通過與5-HT3受體靶向結合刺激迷走神經引起疾病[3]。蠟樣芽孢桿菌分離菌株的毒力基因譜結果見表3。

表3 分離菌株的毒力基因譜Table 3 Virulence gene profile of isolated strains

由表3可知，94個分離菌株都具有腹瀉型毒力基因，且所有菌株均無嘔吐毒素相關的合成基因。其中，5個辣椒醬樣品分離的39個菌株的毒力基因nheA（79%）、nheB（90%）、nheC（87%）、entFM（100%）的陽性率較高，與向婧姝等[24]所述結果一致。4個酸湯樣品分離的35個菌株的毒力基因及nheA（94%）、nheB（100%）、nheC（88%）、entFM（100%）陽性率較高，與辣椒醬樣品檢測結果一致。而2個毛豆腐樣品分離的20個菌株的毒力基因腸毒素hbl、nhe及entFM陽性率均較高，與發酵豆制品中的蠟樣芽孢桿菌的毒力基因陽性率較相似[5]。

蠟樣芽孢桿菌的毒力基因譜具有樣品差異性，大多分離菌株具有多重腹瀉毒力基因。腸毒素容易引發人體腹瀉、腹痛等癥狀，應當同時關注污染菌數及毒素產生量，預防食品中毒事件發生。糧食加工制品中容易存在嘔吐型蠟樣芽孢桿菌污染問題，尤其是米飯及其制品（米飯、米糕、米粉等），而辣椒醬、酸湯、毛豆腐產品的生產發酵環境并不適宜嘔吐型蠟樣芽孢桿菌生長。

2.4 分離菌株的RAPD分型

將94個分離菌株進行RAPD分型，結果見圖2。由圖2可知，94株菌株按聚類分析結果劃分A、B、C三大集群。A集群主要是辣椒醬樣品分離的菌株，B集群主要是辣椒醬樣品和白酸湯樣品分離的菌株，C集群主要是紅酸湯樣品和毛豆腐樣品分離的菌株。同一種類樣品的菌株聚類在同一集群中，說明蠟樣芽孢桿菌的多樣性與樣品差異性有關。辣椒醬樣品分離菌株多樣性較強，不同樣品分離的菌株相似度較低，分布在不同的集群。紅酸湯樣品和白酸湯樣品分離菌株的相似度較低，說明酸湯的原料、發酵條件差異可能導致污染的蠟樣芽孢桿菌不同。

圖2 分離菌株的RAPD模式樹狀圖Fig.2 RAPD pattern tree diagram of isolated strains

3 結論

本實驗研究了辣椒醬、酸湯、毛豆腐三類傳統發酵食品的蠟樣芽孢桿菌污染狀況，并分析了樣品分離菌株的生理生化特征、毒力基因和多樣性。辣椒醬樣品和酸湯樣品的蠟樣芽孢桿菌的檢出率均為100%，但污染菌數不高，菌數在3.6～460 MPN/g之間。毛豆腐樣品的蠟樣芽孢桿菌的檢出率為28.57%，其中夏季樣品的蠟樣芽孢桿菌菌數在7.25～7.39 lg（CFU/g）之間，秋季樣品經GB 4789.14—2014《蠟樣芽孢桿菌檢驗》中的第一法及第二法均未檢出。毛豆腐樣品的蠟樣芽孢桿菌污染菌數差異較大，可能與樣品發酵條件、運輸方式有關，需要實地采樣并進行季節性分析。

從辣椒醬、酸湯和毛豆腐樣品中分離獲得94個菌株，經生理生化鑒定均具有蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）特征。毒力基因分析顯示，來自于辣椒醬樣品和酸湯樣品的74個分離菌株的毒力基因均為腹瀉型，其中腸毒素nhe及entFM陽性率較高；來自于毛豆腐樣品的20個分離菌株，毒力基因均為腹瀉型，其中腸毒素hbl、nhe及entFM陽性率較高。RAPD分型結果顯示，蠟樣芽孢桿菌的多樣性與樣品差異性有關。辣椒醬樣品的分離菌株多樣性較強，不同樣品之間具有較大差異。紅酸湯樣品和白酸湯樣品分離菌株的相似度較低，表明酸湯的原料、發酵條件差異可能導致污染的蠟樣芽孢桿菌不同，而毛豆腐樣品的分離菌株相似度較高。