接種土著和外源AM 真菌對杜梨抗旱性的影響及其適應機制

栗晗，江尚燾，彭海英，李培根，顧長宜，張金蓮，陳廷速，徐陽春，沈其榮，董彩霞?

1 南京農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院，南京 210095；2 廣西農(nóng)業(yè)科學院微生物研究所，南寧 530007

0 引言

【研究意義】梨是我國第三大栽培果樹，主要采用嫁接繁殖，其中杜梨是應用較廣泛的梨樹栽培的主要砧木類型，在北方分布廣泛[1]。近年來全球極端天氣頻發(fā)，高溫熱浪及干旱并發(fā)，嚴重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。梨樹栽培中普遍依靠自然降水，但季節(jié)性干旱現(xiàn)象嚴重，影響樹體健康和果品質(zhì)量。AM（Arbuscular mycorrhizal）真菌是一種廣泛存在于自然界中，能與大多數(shù)植物建立共生關(guān)系的真菌，其發(fā)達的菌絲結(jié)構(gòu)擴大了根系吸收面積，促進植物對水分的吸收，提高植物抗旱能力[2-3]。有研究指出，人為引入新的菌根真菌易造成菌根真菌在植物根系內(nèi)的競爭加劇，導致植物減產(chǎn)[4]。從梨根際土壤中分離土著AM 真菌，比較土著與商業(yè)化AM 真菌對梨苗的促生效果，探究其促生、抗旱機制，可在豐富我國果樹AM 真菌資源庫的同時，為梨菌根化育苗提供理論依據(jù)和有效途徑，對開發(fā)菌根肥料和實現(xiàn)梨果綠色高效生產(chǎn)具有重要意義。【前人研究進展】AM 真菌可緩解干旱脅迫對植物的損傷，一方面，擴大根系水分吸收面積并提高植物水分利用率；另一方面，通過增強生理生化反應改善植物生長及耐旱性[5]，如促進養(yǎng)分吸收、改善光合作用、增強抗氧化酶活、增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量等，有研究表明干旱可加劇菌根在磷吸收中的作用[6]。AM 真菌還可通過間接影響根際微生物功能增強植物抗旱能力，HOANG 等[7]研究表明干旱脅迫下接種AM 真菌增強了大豆根際葡萄糖的滲出，使根際微生物在缺水但仍活躍的根際熱點區(qū)域中增加了磷的利用率。AM 真菌資源廣泛，但果樹AM 真菌研究較少，關(guān)于梨根際土壤AM 真菌的分離也少有報道。目前大多數(shù)研究多集中在商業(yè)菌種，例如，根內(nèi)根孢囊霉Rhizophagus intraradices、摩西斗管囊霉Funneliformismosseae和異形根孢囊霉Rhizophagusirregularis等，這些屬于廣譜性外源AM 真菌。AM 真菌具有不同功能性，F(xiàn)unneliformis mosseae[8]、Rhizophagusirregularis[9-10]等菌劑已被驗證可幫助宿主植物抵御干旱脅迫，具有抗旱能力。許多研究表明[11-12]，土著AM 真菌比外源商業(yè)菌劑效果更好，且在一些園藝作物及育苗生產(chǎn)上，土著AM 菌劑效果優(yōu)于商業(yè)菌劑[13-14]?！颈狙芯壳腥朦c】目前雖然已有關(guān)于干旱脅迫下AM 真菌群落的研究以及抗干旱功能AM 真菌菌劑的報道，但外源AM 真菌與同源土著AM 真菌在抗旱中的作用以及宿主適應脅迫環(huán)境是否與特定AM 菌株豐度的變化有關(guān)亟待研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】驗證梨土著AM 真菌較外源AM 真菌是否對梨苗有更顯著的促生和抗旱效果；在比較不同AM 真菌菌株抗旱能力的基礎(chǔ)上，進一步探究抗旱能力強的AM 菌株在植株遭受水分脅迫時是否具有更高的豐度，篩選出對梨苗促生和抗旱效果較好的菌株并驗證其功能的特異性，揭示AM 真菌應對干旱脅迫的適應機制，也為梨菌根化育苗的實際應用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗于2022 年4—7 月在南京農(nóng)業(yè)大學牌樓溫室進行。

1.1 試驗材料

供試AM 真菌菌種：摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae，BGC HUN03B，F(xiàn)m）、根內(nèi)根孢囊霉（Rhizophagus intraradices，BGC BJ09，Ri）、層狀近明球囊霉CXL-18（Claroideoglomuslamellosum，OQ154984，Cl）和蜜色無梗囊霉YT-6（Acaulosporamellea，OQ154986，Am）。其中，Ri 和Fm 菌劑均購于北京農(nóng)林科學院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，為商業(yè)外源菌劑；Cl 和Am 菌劑分別為梨和桃根際土壤中分離并擴繁得到的土著AM 真菌。該兩種菌種分離自南京市溧水區(qū)相鄰果園，土壤類型一致，根據(jù)宿主來源的不同，將Cl定義為土著同源菌劑，Am 定義為土著外源菌劑。形態(tài)和分子鑒定結(jié)果見圖1 和圖2。接種物均為孢子、菌絲、根段和基質(zhì)等混合物。

圖1 梨和桃根際AM 真菌孢子形態(tài)Fig.1 Morphology of AMF spores in pear and peach rhizosphere

圖2 基于18S rRNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 18S rRNA sequences

培養(yǎng)基質(zhì)：土∶沙=1∶1（v/v），添加2%有機肥，充分混合后經(jīng)121 ℃滅菌2 h 備用。供試土壤采自江蘇省徐州市銅山梨園表層20 cm，其基本理化性質(zhì)為：pH 8.66、有機質(zhì)5.05 g·kg-1、銨態(tài)氮4.03 mg·kg-1、硝態(tài)氮12.55 mg·kg-1、速效磷40.32 mg·kg-1、速效鉀164.63 mg·kg-1、有效鈣3 376.24 mg·kg-1、有效鎂273.49 mg·kg-1。有機肥生產(chǎn)商為淮安柴米河農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，N+P2O5+K2O≥5.0%，有機質(zhì)含量≥45%。

以穴盤育苗2 周苗齡的杜梨實生苗為試驗材料，選取生長一致的幼苗移栽于上口徑11 cm、高13 cm的塑料花盆中，每盆1 株。

1.2 試驗設(shè)計

設(shè)置6 種接種處理，分別為不接種處理（CK）、單接種處理（Ri、Fm、Am、Cl）及混合處理（4 種等孢子量混合，Mix）；設(shè)2 個水分梯度，分別為正常與干旱脅迫。試驗共計12 個處理，每個處理設(shè)置8 個重復。Mix 處理設(shè)置16 個重復，以供在不同時期破壞性取樣。于2022 年4 月，選取生長一致的杜梨苗移栽至裝有600 g 滅菌基質(zhì)的花盆中。每盆添加菌劑于根部及根部下層位置，約1 200 個孢子/盆，不接種處理添加AM 真菌菌劑過濾液以平衡微生物的影響。所有幼苗在土壤最大持水量為75%條件下正常生長9 周后，進行正常與干旱兩種水分處理，干旱處理土壤含水量設(shè)置為土壤最大持水量的35%左右，6 周后收獲。處理幼苗置于南京農(nóng)業(yè)大學人工氣候室中培養(yǎng)，溫度為15—30 ℃，相對空氣濕度為30%—60%。

1.3 樣品采集與分析

1.3.1 植物形態(tài)參數(shù)測定 收獲時分別用卷尺和游標卡尺直接測定8 株杜梨幼苗的株高、莖粗，使用葉面積測定儀SYE-YM02 測定葉面積。將植株清洗干凈，地上（莖、葉）、地下部分（根）分開，蒸餾水沖洗表面，吸干表面水分，置于烘箱中105 ℃殺青30 min 后于75 ℃烘干至恒重，稱量地上部和地下部的干重。每個處理取3 份新鮮葉片參考AGANCHICH 等[15]的方法測定葉片相對含水量，采用乙醇提取-比色法測定葉綠素含量。菌根生長效應通過植株地上部生物量計算[16]。計算公式如下：

菌根生長效應=ln（XAMF/Xnon-AMF）

式中，XAMF：接種AMF 后植株地上部生物量（g）；Xnon-AMF：不接種AMF 的植株地上部平均生物量（g）。菌根氮、磷、鉀、鈣、鎂吸收效應計算方法同菌根生長效應。

1.3.2 植株元素含量測定 將烘干后的樣品磨碎，采用H2SO4-H2O2消煮，流動分析儀測定植株氮（N）含量；采用混酸（濃硝酸∶高氯酸=4∶1）消煮，ICP-OES法測定植株磷（P）、鉀（K）、鈣（Ca）、鎂（Mg）含量。每個處理3 次重復。

1.3.3 菌根侵染測定 將每個處理根系挖出，收集根際土并將根段洗凈，選取新鮮根樣，剪成1—2 cm，放入50%酒精溶液中固定，采用曲利苯藍染色法進行侵染率測定。具體方法如下：加10%氫氧化鉀完全浸泡根系，90 ℃水浴40 min 后用蒸餾水沖洗3—5 次；用10%雙氧水常溫脫色10 min，蒸餾水沖洗3—5 次；用2%鹽酸常溫酸化30 min，蒸餾水沖洗3—5 次；用0.05%曲利苯藍（用乳酸甘油溶液溶解）90℃水浴染色20 min，蒸餾水沖洗3—5 次；置于乳酸甘油（乳酸∶甘油∶水=1∶1∶1）中常溫放置24 h，水洗后進行制片。后續(xù)進行顯微鏡觀察和AMF 侵染率的統(tǒng)計，采用侵染率加權(quán)法計算侵染率。菌絲密度采用真空泵微孔濾膜抽濾法，孢子密度采用濕篩傾析-蔗糖密度梯度離心法[17]。

1.3.4 抗氧化系統(tǒng)指標測定 取每個處理新鮮葉片，液氮研磨成粉，置于-80 ℃保存。使用試劑盒測定各處理間葉片中過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性及丙二醛（MDA）、脯氨酸（Proline，Pro）、可溶性蛋白和可溶性糖的含量。MDA 含量用硫代巴比妥酸法測定，SOD 活性用WST-1 法測定，POD 活性用愈創(chuàng)木酚法測定，CAT活性用鉬酸銨法測定，游離脯氨酸含量用酸性茚三酮法測定，可溶性糖含量用蒽酮比色法測定，可溶性蛋白含量用考馬斯亮藍法測定。所用試劑盒均購買于南京建成生物工程研究所有限公司，具體操作參考相應試劑盒說明書。每個處理3 次重復。

1.3.5 DNA 樣品的采集與提取 干旱處理0、3 和6周時，分別取Mix處理新鮮根際土和根系樣置于-80 ℃保存。分別使用Fast DNATMSPIN Kit 試劑盒和Power Soil? DNA Isolation Kit 試劑盒根據(jù)說明書從根系和根際土樣品中提取總DNA。采用NanoDrop2000 核酸檢測儀（NanoDrop Technologies，Wilmington，德國）對DNA 進行純度檢測，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 完整性。

1.3.6 DNA 樣品的擴增與測序 采用高通量測序技術(shù)分析3 個不同時期正常與干旱條件下Mix 處理根際土與根系DNA 樣品的AMF 基因。對于Illumina MiSeq測序，分別使用引物 GeoA2-AML2[18-19]和 NS31-AMDGR[20-21]通過兩步PCR 獲得18SrDNA 擴增子，使用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl 洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR 產(chǎn)物用QuantiFluor?-ST 藍色熒光定量系統(tǒng)進行檢測定量，然后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。后續(xù)進行Illumina文庫構(gòu)建和測序。具體測序方法參考BABALOLA等[22]。

Illumina 測序得到的PE reads 進行樣本拆分后，首先根據(jù)測序質(zhì)量對雙端reads 進行質(zhì)控和過濾，同時根據(jù)雙端reads 之間的overlap 關(guān)系進行拼接，獲得質(zhì)控拼接之后的優(yōu)化數(shù)據(jù)。然后使用序列降噪方法（DADA2）處理優(yōu)化數(shù)據(jù)，獲得 ASV（amplicon sequence variant）代表序列和豐度信息。使用AM 真菌標準序列及分子鑒定所得序列進行物種注釋。測序過程交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3.7 AMF gDNA 豐度的測定 AMF gDNA 豐度測定采用實時定量PCR 法（探針法）測定?？紤]到實驗室和菌種庫條件，本試驗僅對Fm 和Ri 兩種AMF 的gDNA 豐度進行測定，具體方法參考李俠等[16]。根際土豐度測定方法與根系相同。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22 進行方差分析，采用獨立樣本t檢驗比較梨苗根系及根際土AMF gDNA 豐度在2 種菌種間及不同水分條件下的差異。采用GraphPad Prism 9進行簡單線性回歸及作圖；采用RStudio 進行AM 真菌群落β多樣性作圖。

2 結(jié)果

2.1 不同水分條件下不同接種處理對杜梨幼苗長勢及養(yǎng)分吸收的影響

2.1.1 對幼苗生長的影響 接種AM 真菌顯著促進杜梨幼苗的生長。正常及干旱條件下單接Ri 及Mix接種均顯著提高杜梨幼苗株高、莖粗、葉面積，促生效果最好，單接Cl 效果次之。單接Am 效果略優(yōu)于CK，而單接Fm 與CK 效果相似。與正常條件相比，干旱條件下單接Ri、Am 及Mix 處理葉綠素含量分別增加26.61%、19.12%、26.56%，均高于CK處理（14.69%）。正常條件下，單接Ri、Cl 及Mix處理顯著提高杜梨幼苗干重，分別提高41.76%、49.45%、52.20%，單接Fm 效果最差，表現(xiàn)為負效應。干旱條件下，單接Cl 及Mix 處理顯著提高杜梨幼苗干重，分別提高35.26%、35.90%。正常及干旱條件下，不同接種處理均顯著提高葉片相對含水量（表1）。

2.1.2 對幼苗養(yǎng)分吸收的影響 AM 真菌對植物生長表現(xiàn)有正效應、負效應、無效應。通過計算不同接種處理杜梨幼苗地上部菌根生長效應（圖3-A）發(fā)現(xiàn)，單接Ri、Cl、Am 及Mix 處理均顯著促進杜梨幼苗生長，但效果不一。而單接種Fm 在正常條件下表現(xiàn)為抑制杜梨幼苗生長，干旱條件下這種負效應消失。正常與干旱條件下，Mix 處理效果最好，單接Ri、Cl效果次之。

圖3 正常及干旱條件下不同接種處理杜梨幼苗菌根生長效應（A）及氮（B）、磷（C）、鉀（D）、鈣（E）、鎂（F）吸收效應Fig.3 Mycorrhizal growth response (A) and mycorrhizal nitrogen (B), phosphorus (C), potassium (D), calcium (E) and magnesium(F) uptake response of P.betulaefolia shoot inoculated with different AMF species under normal and drought conditions

通過計算不同接種處理杜梨幼苗地上部菌根元素吸收效應發(fā)現(xiàn)，與其他接種處理相比，正常和干旱條件下單接Ri、Cl 及Mix 處理顯著促進杜梨幼苗地上部磷、鉀、鈣、鎂等元素的吸收，尤其是磷的吸收，吸收效應最高達1.0 以上，而其菌根氮吸收效應僅在干旱條件下最顯著。正常條件下單接種Fm 的菌根元素吸收效應均表現(xiàn)為負效應，而在干旱條件下負效應消失，甚至促進氮、磷元素的吸收。正常條件下，單接種Am 顯著促進磷、鈣、鎂的吸收，干旱下表現(xiàn)為抑制植物鉀元素的吸收，氮、磷、鈣、鎂元素吸收在接種處理間最低（圖3-B—F）。

2.2 不同水分條件下不同接種處理對杜梨幼苗菌根侵染的影響

單接種Ri、Fm、Am 和Cl 及Mix 接種均對杜梨幼苗根系有較好的侵染。單接種Ri 和Mix 處理侵染強度及叢枝豐度在正常及干旱條件下均較高。干旱條件下，單接種Ri、Cl 侵染強度顯著上升，其他接種處理無顯著變化。與其他接種處理相比，干旱條件下單接種Cl 叢枝豐度顯著上升，其他接種處理均有不同程度下降。不同接種處理在干旱條件下的菌絲密度均高于其在正常條件下的菌絲密度，且除單接種Am 處理外，其他均達到顯著水平，Mix 處理菌絲密度最高，Cl、Ri 次之。但單接Fm 的菌絲密度增加幅度最高，為118%。除單接種Fm 外，其他接種處理的孢子密度在干旱條件下均顯著下降（表2）。

表2 正常及干旱條件下不同接種處理杜梨幼苗菌根侵染情況、根外菌絲密度和孢子密度Table 2 Mycorrhizal infection, hyphal density and spore density of P.betulaefolia seedlings inoculated with different treatments under normal and drought conditions

2.3 不同水分條件下AM 真菌生長與功能的關(guān)系

AM 真菌侵染強度作為自變量，菌根生長效應和氮、磷、鉀、鈣、鎂吸收效應分別作為因變量進行簡單線性回歸分析（圖4）。正常條件下，回歸方程分別是：菌根生長效應=侵染強度×0.020-0.325；菌根氮吸收效應=侵染強度×0.015-0.435；菌根磷吸收效應=侵染強度×0.023-0.214；菌根鉀吸收效應=侵染強度×0.019-0.437；菌根鈣吸收效應=侵染強度×0.013-0.100；菌根鎂吸收效應=侵染強度×0.015-0.152。干旱條件下，回歸方程分別是：菌根生長效應=侵染強度×0.013-0.076；菌根氮吸收效應=侵染強度×0.007+0.056；菌根磷吸收效應=侵染強度×0.020-0.009；菌根鉀吸收效應=侵染強度×0.014-0.308；菌根鈣吸收效應=侵染強度×0.012-0.127；菌根鎂吸收效應=侵染強度×0.012-0.174。AM 真菌侵染強度與梨苗生長及元素吸收均具有較強正相關(guān)性，干旱條件下更為顯著。

圖4 正常及干旱條件下AM 真菌侵染強度與菌根生長和養(yǎng)分吸收效應的關(guān)系Fig.4 Relationship between AM fungal infection intensity and mycorrhizal growth and nutrition uptake response under normal and drought conditions

2.4 干旱脅迫下不同接種處理對杜梨幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響

干旱脅迫使杜梨幼苗MDA 含量增加，但接種AM真菌處理的MDA 含量均顯著低于CK 處理（圖5）。干旱脅迫下，單接種Am 及Mix 處理均顯著提高CAT活性，其他接種處理無顯著影響；與CK 相比，單接種Ri、Fm 和Mix 處理顯著提高POD 活性，單接種Am 顯著下降，單接種Cl 無顯著影響；單接種Ri 顯著提高SOD 活力，其他接種處理無顯著影響；與CK相比，單接種Ri、Cl 及Mix 處理顯著提高杜梨幼苗葉片脯氨酸含量，可溶性糖含量無顯著增加，單接種Fm、Am 處理對杜梨幼苗葉片脯氨酸含量無顯著影響，可溶性糖含量顯著下降。與CK 處理相比，單接種Fm、Am 及Mix 處理可溶性蛋白含量顯著下降，單接種Ri、Cl 無顯著影響。

2.5 不同干旱時期混合處理杜梨幼苗根系及根際土AM 真菌群落變化

通過基于根系與根際土AM 真菌組成群落水平的主坐標分析（CPCoA）發(fā)現(xiàn)，干旱處理與正常處理間的AM 真菌群落組成明顯不同，根際土中更為顯著，而3 周與6 周間AM 真菌群落組成未明顯分開（圖6）。

圖6 正常及干旱處理根系（左）和根際土（右）AM 真菌β 多樣性主坐標分析圖Fig.6 Principal coordinate analysis of AM fungal β diversity in root (left) and root soil (right) during normal and drought treatments

不同時期杜梨幼苗根系和根際土AM 真菌群落組成不同（圖7），但Ri 豐度占主導。如表3 所示，根系Ri、Cl 豐度變化顯著受水分處理的影響（P=0.012、P=0.025），但不受處理時間影響（P=0.061、P=0.052）。在干旱處理6 周時根系Ri 豐度顯著升高（P=0.040）。根際土Ri、Cl 豐度變化顯著受水分處理（P=0.000、P=0.002）影響，Ri、Am 豐度顯著受處理時間影響（P=0.032、P=0.030）。根際土Ri 豐度在干旱3、6周時均顯著上升（P=0.002、P=0.025），Cl 豐度在干旱3 周時顯著下降（P=0.009）。

表3 干旱和時間對杜梨幼苗根系及根際土AM 真菌豐度的影響Table 3 Effects of drought and time on AM fungal abundance in roots and rhizosphere soil of P.betulaefolia seedlings

圖7 正常及干旱0、3、6 周混合處理根系（A）和根際土（B）AM 真菌組成群落圖Fig.7 Composition of AM fungi in root (A) and root soil (B) after 0, 3 and 6 weeks of normal and drought mixed treatment

通過對干旱6 周根系和根際土Ri、Fm 的絕對定量驗證（圖8）發(fā)現(xiàn)，Ri 豐度顯著高于Fm 豐度，與高通量測序結(jié)果一致。干旱脅迫下，根系與根際土中Ri 豐度顯著升高，而Fm 豐度無顯著差異。

圖8 正常及干旱處理6 周根系（左）和根際土（右）AM 真菌gDNA 豐度Fig.8 AM fungi gDNA abundance in root (left) and root soil (right) after 6 weeks of normal and drought treatment

3 討論

3.1 干旱條件下接種土著AM 真菌影響杜梨幼苗生長及養(yǎng)分吸收

AM 真菌是分布最為廣泛的一類真菌，在果園中也普遍存在。AM 真菌具有功能多樣性，一方面可通過擴大菌絲面積促進宿主水分及養(yǎng)分吸收；另一方面調(diào)節(jié)宿主植物滲透代謝及相關(guān)酶活或基因表達等增強植物對逆境的耐性。本研究發(fā)現(xiàn)，除單接種外源菌劑Fm 處理外，正常及干旱脅迫下單接種AM 真菌及Mix接種處理均顯著促進了杜梨幼苗生長，其中單接種外源菌株Ri、梨土著菌株Cl 及Mix 接種處理效果較好，外源菌株Am 效果其次，促生效果因AM 真菌種類而不同。王紫瑄等[23]發(fā)現(xiàn)對蒙古沙冬青幼苗單接與混接根內(nèi)根孢囊霉（R.intraradice）和摩西斗管囊霉（F.mosseae）均顯著增加植物株高、生物量。駱禮華[24]研究發(fā)現(xiàn)接種外源菌株F.mosseae對金佛山方竹的促生效果優(yōu)于接種土著菌株A.mellea，ZOU 等[25]在甘草上也發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果。C.lamellosum已被報道可顯著提高柑橘砧木資陽香橙的株高、莖粗、葉片數(shù)[26]。前人研究結(jié)果表明菌株Ri、Fm、Am 和Cl 均具有促生能力，但促生能力不一，與本研究結(jié)果相似。植物-土壤反饋同時受到寄主物種和AM 真菌接種物的影響，接種同源AM 真菌的植株生長往往優(yōu)于接種外源AM 真菌[27]。本研究中外源菌株Am 對杜梨幼苗的促生效果不如梨土著菌株Cl 及廣譜性外源菌株Ri，外源菌株Fm 在正常條件下抑制杜梨幼苗生長，造成這種差異的原因可能是菌株對杜梨親和性不同。另一方面，干旱脅迫下，接種處理對杜梨幼苗葉片相對含水量、葉綠素含量及相關(guān)抗氧化酶活性也有不同程度的提高，活性氧清除降低氧化損傷，滲透平衡及光合作用得到了改善，有利于梨苗抵御脅迫。AM 真菌還可改善植物營養(yǎng)。植物與AM 真菌間碳水化合物和礦質(zhì)養(yǎng)分的物質(zhì)交換是自然界物質(zhì)循環(huán)的重要內(nèi)容。已有研究表明，AM 真菌顯著促進植物吸收N、P、K、Fe、Mn和Cu，以抵御干旱脅迫[28]。本研究中干旱下接種處理均不同程度地顯著提高杜梨幼苗對元素的吸收，對磷吸收效果最顯著，且菌根生長效應及元素吸收效應均與侵染強度呈正相關(guān)，與正常條件下相比，其相關(guān)性在干旱脅迫下均增強，表明在脅迫條件下AM 真菌的侵染有利于植物對養(yǎng)分的吸收。

AM 真菌與植物間的聯(lián)系是相互的，也受環(huán)境影響。本研究中AM 真菌均對杜梨幼苗有較好的侵染，但侵染強度有所不同，外源菌株Ri 及Mix 處理侵染強度較強。已有研究表明在人為合成AM 真菌群落時，Rhizophagus屬通常是最成功的植物根定植體[29]。與其他接種處理相比，干旱脅迫下單接種外源菌株Ri 和土著菌株Cl 的侵染強度顯著上升，且土著菌株Cl 的叢枝豐度也顯著上升，而AM 真菌菌絲一般是在土壤肥力良好的環(huán)境中形成較多的叢枝吸收養(yǎng)分，當肥力較低時菌絲以菌絲圈形式吸收和儲存能量[30]。3 種處理在干旱下侵染情況不一，可能是不同AM 真菌種類與環(huán)境相互作用的結(jié)果，叢枝在細胞中周轉(zhuǎn)也比較快。干旱脅迫下，接種處理根際菌絲密度均有顯著上升，尤其是單接種Fm 處理。有研究表明，F(xiàn)unneliformis屬可以在土壤中形成非常廣泛的菌絲網(wǎng)絡(luò)，可能橋接在干燥的土壤塊間，促進礦物質(zhì)營養(yǎng)的吸收及將水從遠處土壤引向植物[31]。這也表明AM 真菌通過擴大菌絲面積幫助植物增加水分吸收，進而抵御干旱脅迫。干旱脅迫不利于AM 真菌孢子的繁殖。劉海躍等[32]發(fā)現(xiàn)沿荒漠植物花棒天然分布帶由東到西隨干旱程度增加，AM 真菌孢子密度逐漸降低，這與本研究中接種處理的孢子密度在干旱脅迫下均顯著下降相一致。另外，不同AM 真菌孢子密度不同也側(cè)面說明不同菌株存在不同步的生長周期。

AM 真菌具有特異性，它對植物的影響可從共生跨越到寄生。本研究中，單接種外源菌株Fm 對杜梨幼苗生長表現(xiàn)為負效應，但干旱脅迫下負效應消失。KAUR 等[33]用兩種AM 真菌（Rhizophagusirregularis和Gigasporagigantea）分別接種高粱，也觀察到了正面和負面效應。植物對AM 真菌接種的反應取決于環(huán)境。AM 真菌對植物生長的影響也因植物-AM 真菌特異性而異[27]。已有研究表明，F(xiàn).mosseae的接種可顯著促進干旱脅迫下小馬鞍羊蹄甲[34]、胡楊[35]、青岡櫟[36]等的生長，表現(xiàn)出其強大的抗干旱能力。本研究中Fm 菌株在正常條件下不利于杜梨幼苗生長，表現(xiàn)為寄生，而它在干旱脅迫下與植物轉(zhuǎn)變?yōu)楣采P(guān)系，能促進氮、磷的吸收，表明Fm 利于干旱脅迫下梨苗生長，只是當前土壤條件不利于其生長與繁殖。有研究指出植物和土著菌株組合的生長表現(xiàn)或者抗逆性顯著優(yōu)于植物和外源菌株組合[12]，說明利用土著菌根真菌以促進植物生長比引入外來菌根真菌的效應更加穩(wěn)定，也不易造成生態(tài)失衡。本研究中單接外源商業(yè)菌株Ri 的效果顯著優(yōu)于外源商業(yè)菌株Fm，梨土著菌株Cl 效果顯著優(yōu)于外源菌株Am，表明并非所有商業(yè)菌劑均適用于梨，土著AM 菌株的效果也不一定優(yōu)于外源AM 菌劑，但同源土著AM 菌劑效果優(yōu)于外源土著AM 菌劑效果。

3.2 梨苗AM 真菌群落對干旱的響應

親緣關(guān)系較遠的AM 真菌在功能上往往也具有較大的差異，因此與單一AM 真菌相比，不同AM真菌在植物根系定殖具有功能互補效應，幫助宿主植物應對不同環(huán)境的變化[37]。植物對不同AM 真菌的敏感性不同，宿主傾向更具合作性的AM 真菌提供資源[38]。本研究中，干旱脅迫下杜梨幼苗根系及根際土AM 真菌群落結(jié)構(gòu)顯著不同于正常條件，但外源菌株Ri 均占主導。SYMANCZIK 等[39]從沙漠中分離出4 種土著AM 真菌，以高粱為宿主，并引入外源菌株Rhizophagusirregularis，探究不同水分處理對AM真菌豐度的影響，研究發(fā)現(xiàn)在干旱條件下，引入Rhizophagusirregularis會降低根中所有土著AM 真菌物種的總豐度。EMERY 等[40]研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫顯著改變了柳枝稷的 AM 真菌群落組成，主要是Rhizophagus類群豐度的增加。AM 群落功能的差異與某些AM 真菌物種的豐度有關(guān)[41]。菌株Ri 豐度較高一方面是其菌種特性決定的，另一方面因為它本身具有抗干旱能力，有利于梨苗干旱下的生長。本研究中，根系及根際土AM 真菌群落豐度均受干旱脅迫影響，干旱脅迫下外源菌株Ri 豐度顯著上升，梨土著菌株Cl 豐度顯著下降，而外源菌株Fm 所占豐度幾乎沒有，外源菌株Am 豐度無顯著變化，通過定量發(fā)現(xiàn)根系及根際土中外源菌株Ri 豐度顯著上升，F(xiàn)m 豐度無顯著變化。Fm 只在干旱處理前能被檢測到，且在根系及根際土中豐度均較低，根據(jù)其在杜梨幼苗上單一接種結(jié)果分析，它在群落中競爭能力較弱，進一步印證該試驗條件不利于其生長。梨土著菌株Cl 在單一接種時表現(xiàn)為明顯的促生及抗旱效果，而在Mix 處理時效果不顯著，可能是受到外源菌株Ri 的影響，干旱脅迫下Cl 對植物的效益不如Ri，植物對AM 真菌的選擇更傾向于合作利益最大化的一方。NACOON 等[42]對洋姜分別接種分離到的4 種土著AM 真菌及從桉樹根際土壤分離出的菌株A.mallea，研究發(fā)現(xiàn)A.mallea在正常和干旱條件下均未顯著促進洋姜的生長和產(chǎn)量。Am自身對植物生長的影響較小，在杜梨幼苗上的促生能力也較弱，另一方面也因為它是外源土著菌株，對梨親和性不強。根際土中AM 真菌群落結(jié)構(gòu)還受到時間影響，隨著時間的變化，外源菌株Ri 豐度逐漸下降，外源菌株Am 顯著上升，這可能與無梗囊霉屬AM 真菌在暖季產(chǎn)孢的物候特性有關(guān)[43]。綜上所述，干旱脅迫下Mix 接種處理中AM 真菌群落發(fā)生了改變，群落中外源菌株Ri 更有利于植物抵御干旱脅迫，并且豐度占據(jù)主導位置。

4 結(jié)論

本研究通過梨苗促生盆栽試驗，發(fā)現(xiàn)正常及干旱脅迫下，梨土著菌株Cl 和外源菌株Ri 及Mix 處理均顯著促進杜梨幼苗生長，篩選出了對梨苗促生耐旱能力較好的菌株，而外源菌株Fm 與Am 對杜梨幼苗促生效果較弱，表現(xiàn)出AM 真菌促生及抗旱能力的差異。研究結(jié)果也表明并非所有商業(yè)菌劑均適用于杜梨，土著AM 菌株的效果也不一定優(yōu)于外源AM 菌劑，但同源土著AM 菌劑效果優(yōu)于外源土著AM 菌劑效果。高通量測序及絕對定量結(jié)果表明干旱脅迫下Mix 接種處理有利于杜梨幼苗生長，這與AM 真菌群落中利于抵御干旱脅迫的菌株Ri 豐度上升有關(guān)。