徐重新，金嘉鳳，孫曉明，沈成,3，張霄，陳澄宇，劉賢金，劉媛

1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所/省部共建國家重點實驗室培育基地-江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室，南京 210014；2 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；3 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，南京 210023

0 引言

Bt 毒素是蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis）代謝產(chǎn)生的一類具有特異性殺蟲功能的大分子蛋白，典型代表為伴胞晶體殺蟲蛋白（Cry 和Cyt，屬δ內(nèi)毒素）和分泌到胞外的營養(yǎng)期殺蟲蛋白（Vip），也有微量分泌型殺蟲蛋白（Sip），但因殺蟲活性弱和制備困難，幾乎不被關(guān)注。目前獲認證命名的Bt Cry/Cyt/Vip 毒素已達1 005 種，涵蓋Cry 家族78 亞類818 種、Cyt 家族3 亞類40 種和Vip 家族4 亞類147 種（數(shù)據(jù)來源于國際Bt 毒素權(quán)威統(tǒng)計網(wǎng)站http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/）；此外，仍有新的亞型被發(fā)現(xiàn)的報道[1]。Bt 毒素由于特異性對鱗翅目如小菜蛾（Plutellaxylostella）、鞘翅目如馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsadecemlineata）、雙翅目如埃及伊蚊（Aedesaegypti）等多種常見害蟲具有較強毒殺活性，而對絕大多數(shù)非靶標(biāo)生物特別是人類及高等動物相對較為安全，其現(xiàn)以制劑或轉(zhuǎn)基因作物的形式廣泛用于害蟲綠色防控。截至2023 年6 月，中國農(nóng)藥信息網(wǎng)（http://www.chinapesticide.org.cn）數(shù)據(jù)顯示，僅在中國登記的生物農(nóng)藥制劑有效成分含Bt 毒素的產(chǎn)品就達240 余種；而其轉(zhuǎn)基因作物在全球的種植面積更是超過1 億公頃，商品化品種涵蓋水稻、小麥、玉米、馬鈴薯、大豆、木瓜、棉花、煙草等世界主要經(jīng)濟作物，帶動相關(guān)作物年均增產(chǎn)價值超過190 億美元[2]。然而隨著Bt 毒素長期廣泛應(yīng)用，靶標(biāo)害蟲抗藥性也逐漸顯現(xiàn)，報道顯示，目前在野外發(fā)現(xiàn)至少有小菜蛾、草地貪夜蛾（Spodopterafrugiperda）、粉紋夜蛾（Trichoplusiani）、灰翅鈴夜蛾（Helicoverpapunctigera）、棉鈴蟲（Helicoverpaarmigera）、棉紅鈴蟲（Pectinophora gossypiella）、玉米螟（Ostriniafurnacalis）7 種鱗翅目和山楊葉甲（Chrysomelatremulae）1 種鞘翅目害蟲對一些成熟應(yīng)用的Bt 毒素（如Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ah、Cry1B、Cry1C、Cry1F、Cry1J、Cry2Aa、Cry2Ab、Cry2Ae、Cry3Aa 等）產(chǎn)生了抗性[3]；此外，部分Bt毒素如Cry1Aa、Cry1Ai、Cry1Ca、Cry1Fa 和Cry2Aa對家蠶（Bombyxmori）[4-6]、Cry1Ab 和Cry3Bb 對二星瓢蟲（Adaliabipunctata）[7]、Cry5B 和Cry6Aa 對秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans）[8-9]等特定非靶標(biāo)生物具有較強的交互致死毒性，這些問題越來越掣肘Bt毒素在害蟲防治上的進一步應(yīng)用。盡管如此，Bt 毒素仍然是當(dāng)今世界公認的最具價值的綠色高效殺蟲蛋白，可挖掘的潛力和創(chuàng)新應(yīng)用空間巨大。

近年來，得益于分子與生物信息學(xué)和基因工程技術(shù)快速發(fā)展，一些代表性的Bt 毒素（Cry、Cyt、Vip）結(jié)構(gòu)功能及其對相應(yīng)靶標(biāo)害蟲的活性機制日趨明晰，特別是3D Cry 類型Bt 毒素以活化態(tài)（關(guān)鍵結(jié)構(gòu)如Domain I/II/III）與靶標(biāo)害蟲中腸鈣黏蛋白（cadherin，CAD）、腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC 轉(zhuǎn)運蛋白）等關(guān)鍵受體強力互作誘發(fā)腸道細胞功能損傷進而導(dǎo)致蟲體死亡的基本作用模式已經(jīng)成為共識。由此，基于Bt 毒素關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域并結(jié)合其與靶標(biāo)害蟲潛在關(guān)鍵受體特異性互作的特性，為理性設(shè)計活性更高[10-11]、穩(wěn)定性更強[12]、殺蟲譜更廣[13]、對非靶標(biāo)生物安全性更高[14]甚至可應(yīng)對靶標(biāo)害蟲抗藥性[15]的有別于母體Bt 毒素的突變體、結(jié)構(gòu)雜合體乃至殺蟲功能效應(yīng)物抗體等新型殺蟲蛋白創(chuàng)造了可能；同時也為理性設(shè)計諸如特異性鈣黏蛋白片段[16]、類鈣黏蛋白片段[17]、小菜蛾P(guān)xHsp90 蛋白[18]等輔助增效，蘇云金芽孢桿菌P20 蛋白[19]、LEA-II 肽[20]等促進表達，乃至借鑒化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配模式的包括不同Bt 毒素[21]或具殺蟲功能的幾丁質(zhì)酶[22]、蛋白酶抑制劑[23]、凝集素[24]、蜘蛛毒素[25]等材料在內(nèi)的各類同源或異源增效物協(xié)同Bt 毒素防治靶標(biāo)害蟲的創(chuàng)新應(yīng)用策略指明了方向。基于此，本文通過文獻調(diào)研，在全面總結(jié)Bt 毒素結(jié)構(gòu)功能及其對靶標(biāo)害蟲作用機制的基礎(chǔ)上，較為系統(tǒng)地梳理了基于Bt 毒素功能修飾的突變體、結(jié)構(gòu)雜合體以及殺蟲功能模擬效應(yīng)物抗體等新型殺蟲蛋白理性設(shè)計和基于Bt 毒素功能增效的創(chuàng)新應(yīng)用策略等方面的研究進展，并結(jié)合作者團隊部分最新研究成果，對基于Bt 毒素的殺蟲蛋白理性設(shè)計與創(chuàng)新應(yīng)用策略在未來可能拓展的方向進行了深入探討，有望為相關(guān)研究提供較為全面的、具有重要參考借鑒價值的文獻資料和潛在啟發(fā)思路。

1 Bt 毒素結(jié)構(gòu)功能與活性機制

1.1 Cry 家族毒素

Cry 家族毒素是最具代表性的Bt 毒素類型，其殺蟲譜涵蓋鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、半翅目、膜翅目及線蟲、蝸牛等，甚至個別亞種對人類癌細胞具有強特異性致死活性（表1）。Cry 家族毒素盡管在進化上具有一定保守性，但并不是所有亞種都是單一同源的蛋白家族，按結(jié)構(gòu)功能和進化保守性可劃分為原毒素經(jīng)酶解后活化為 3 個功能結(jié)構(gòu)域（Domain I-II-III）的Three-Domain Cry（3D Cry）類型、原毒素與球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillussphaericus）產(chǎn)生的二元毒素（binary toxin，Bin）氨基酸功能結(jié)構(gòu)類似的Bin-like Cry 類型和原毒素關(guān)鍵活性結(jié)構(gòu)及作用模式與保守的梭狀芽孢桿菌ε毒素（epsilon toxin，ETX）或球形賴氨酸芽孢桿菌殺蚊毒素（mosquitocidal toxin，MTX）類似的ETX/MTX 家族-like Cry 類型；此外，還有極其獨特的不具殺蟲活性但能特異性對包括人類在內(nèi)的哺乳動物癌細胞產(chǎn)生強致死活性的Parasporin Cry 類型。

表1 Bt 毒素主要作用對象Table 1 The main targets of Bt toxins

3D Cry 類型是絕大多數(shù)Cry 家族毒素的共有特質(zhì)，其原毒素的分子量大多聚集在135 kDa 左右：如Cry1類（～135 kDa）、Cry 8Ea1（128 kDa）、Cry9Ca/Ec1（130 kDa）等和聚集在65 kDa 左右：如Cry2Aa（65 kDa）、Cry39A（63 kDa）、Cry44Aa（64.1 kDa）、Cry59A（64.2 kDa）、Cry11A（72 kDa）等，前者毒素分子肽鏈的C 端一般都存在一段分子量在70 kDa 左右的與毒素結(jié)晶形成有關(guān)的非活性結(jié)構(gòu)，而后者毒素分子肽鏈的C 端則不存在這種結(jié)構(gòu)，這類毒素結(jié)晶形成需要借助其他輔助蛋白或特殊的上下游基因調(diào)控元件才能實現(xiàn)[26]。3D Cry 類型毒素在進化上相對較為保守（多數(shù)存在5 個保守區(qū)域Block1—5），幾乎所有亞型的原毒素經(jīng)靶標(biāo)害蟲腸道堿性環(huán)境酶解后均產(chǎn)生分子量為60—70 kDa 的由3 個功能結(jié)構(gòu)域（Domain I-II-III）組成的活化態(tài)結(jié)構(gòu)[27]。其中，Domain I 是位于N 端200—250 個氨基酸的由6—7 個親水性α-螺旋包裹中心1個疏水性α-螺旋（α5）的特殊結(jié)構(gòu)，其參與了毒素蛋白寡聚物形成并與靶標(biāo)害蟲腸壁蛋白結(jié)合、插入細胞膜形成穿孔，是毒素發(fā)揮殺蟲功能的關(guān)鍵區(qū)域[28]；Domain II 是由居中的200 個氨基酸左右的由3 個反向平行的β折疊組合片段包裹形成希臘鑰匙（Greek-key）拓撲結(jié)構(gòu)并附帶2 個短螺旋，其中3 個β折疊組合片段頂端裸露的Loop 環(huán)牽引毒素特異性識別并結(jié)合受體，從而決定毒素對靶標(biāo)害蟲的特異性[29]；Domain III是位于C 端的150 個氨基酸左右的由2 個扭曲的反向平行的β折疊組合片段包裹形成β-sandwich 夾心拓撲結(jié)構(gòu)，參與不同靶標(biāo)害蟲中腸受體結(jié)合互作和細胞膜插入過程，同時也是維持毒素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要部分[11]；Domain II/III 共同決定毒素蛋白作用靶標(biāo)害蟲的類型。目前3D Cry類型毒素對靶標(biāo)害蟲的活性機制相對較為明晰，主流觀點認為，靶標(biāo)害蟲取食該類原毒素后，腸道堿性環(huán)境中的蛋白水解酶首先對毒素N 端和C 端非活性區(qū)域肽段進行特異性水解，形成分子量為60—70 kDa 的Domain I-II-III 活化態(tài)，從而穿過圍食膜與中腸細胞纖維膜上高豐度的氨肽酶-N（aminopeptidase N，APN）、堿性磷酸酶（akaline phosphatase，ALP）初步結(jié)合識別，接著毒素蛋白核心區(qū)域靶向與中腸上皮細胞刷狀緣膜囊泡（brush border membrane vesicles，BBMV）上的一級受體CAD 強力結(jié)合（Kd值可達1 nmol·L-1），在特殊蛋白酶作用下，Domain I 的N 端α1肽段被切除，引起活化態(tài)毒素形成低聚物實現(xiàn)單體寡聚化（Domain II 的loop 和Domain III 的功能位點裸露），進而與細胞膜上由糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）錨定蛋白牽引的高豐度二級受體氨肽酶-N、堿性磷酸酶等非強力結(jié)合（Kd值＞100 nmol·L-1），進一步促進活化態(tài)毒素寡聚化，再次增強毒素與CAD 的親和力并同步與跨膜蛋白腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白（ABC 轉(zhuǎn)運蛋白）強力互作，產(chǎn)生循環(huán)級聯(lián)放大效應(yīng)，由此在CAD、APN、ALP、ABC 轉(zhuǎn)運蛋白（ABCC2/ABCC3）等系列受體牽引下，活化態(tài)毒素穿插到細胞膜造成穿孔裂解，引發(fā)靶標(biāo)害蟲腸道功能損傷、消化吸收受阻、拒食，最終導(dǎo)致蟲體死亡，即為“穿孔形成模型”[30]。也有觀點認為，靶標(biāo)害蟲取食的原毒素在腸道堿性環(huán)境中被水解形成Domain I-II-III 活化態(tài)，由此穿過圍食膜直接與中腸上皮細胞BBMV 上的CAD 受體強力結(jié)合，在特殊蛋白酶的作用下，Domain I 的N 端α1 肽段被切除形成低聚物實現(xiàn)單體寡聚化，進而激發(fā)細胞膜上由α、β、γ3 個亞基組成的膜蛋白GTP 偶聯(lián)調(diào)節(jié)蛋白（G 蛋白，G protein）系統(tǒng)和Mg2+依賴的膜整合蛋白腺苷酸環(huán)化酶（adenylylcyclase，AC）系統(tǒng)，引發(fā)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）瞬時過表達，激活蛋白激酶A（proteins kinase A，PKA）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，觸發(fā)一系列不可逆修復(fù)的級聯(lián)生化反應(yīng)，導(dǎo)致細胞膜內(nèi)外離子滲透壓失衡、細胞骨架不穩(wěn)坍塌，造成靶標(biāo)害蟲腸道功能損傷、消化吸收受阻、拒食，最終導(dǎo)致蟲體死亡，是為“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模型”[30]。

Bin-like Cry 類型毒素如Cry34、Cry35Aa,b,c/Ba、Cry36、Cry49Aa 等氨基酸序列較為保守，結(jié)構(gòu)和功能與球形賴氨酸芽孢桿菌二元毒素Bin-A/B 極為類似，這類原毒素的分子量主要聚集在40—60 kDa，富含功能性β-折疊結(jié)構(gòu)，目前其對靶標(biāo)害蟲的作用機制尚不清楚，初步研究證據(jù)認為該類型原毒素進入靶標(biāo)害蟲腸道堿性環(huán)境后會被水解為毒性更強的活化態(tài)肽鏈，進而在裸露的功能性β-折疊結(jié)構(gòu)主導(dǎo)下與腸壁細胞BBMV 上的特異性受體強力互作，引起細胞膜穿孔，造成蟲體死亡[31]。而ETX/MTX 家族-like Cry 類型毒素如Cry15Aa、Cry23Aa、Cry33Aa、Cry38Aa、Cry51Aa1,a2、Cry60以及CryC35、CryNT32 等整體氨基酸序列多樣、一致性較低，但它們對靶標(biāo)害蟲的關(guān)鍵活性結(jié)構(gòu)和作用機制較為相似，研究表明這類毒素大致由兩個結(jié)構(gòu)域組成，N 端較小的頭部結(jié)構(gòu)域由多樣性豐富的短肽α螺旋和β折疊構(gòu)成，是受體識別的關(guān)鍵區(qū)域，決定相應(yīng)毒素作用不同靶標(biāo)害蟲，而C 端較大的尾部結(jié)構(gòu)域氨基酸較為保守，多數(shù)都擁有與氣單胞菌細胞溶素較為相似的多組功能性β-折疊結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)寡聚化主導(dǎo)毒素與靶標(biāo)害蟲中腸BBMV 上的特異性跨膜蛋白受體強力互作，導(dǎo)致腸壁細胞膜發(fā)生β-barrel 穿孔，造成蟲體死亡[32]。Parasporin Cry 類型現(xiàn)有的 6 組毒素 Cry31Aa,b,c（Parasporin1）、Cry46Aa,b（Parasporin2）、Cry41Aa,b（Parasporin3）、Cry45Aa（Parasporin4）、Cry64Aa/Ba/Ca（Parasporin5）、Cry63Aa（Parasporin6）的氨基酸序列在進化上與3D Cry 類型相距較遠，而與ETX/MTX家族-like Cry 類型相對較近，其中Parasporin5（Cry64）有時也被認為是ETX/MTX 家族-like Cry 類型[33]；這類原毒素需要借助胰蛋白酶或蛋白激酶K 等特殊蛋白酶水解形成25—65 kDa 的活化態(tài)才具有細胞毒性，其關(guān)鍵活性單元同樣與氣單胞菌細胞溶素類似，富含功能性β-折疊結(jié)構(gòu)，目前推測認為這種結(jié)構(gòu)進一步寡聚化能特異性結(jié)合哺乳動物癌細胞細胞膜上GPI 錨定蛋白受體并產(chǎn)生強力級聯(lián)互作，從而誘發(fā)癌細胞空泡性腫脹、裂解或穿孔性坍塌，造成強烈的細胞毒性[29,34]。

1.2 Cyt 家族毒素

Cyt 家族3 個亞類（Cyt1—3）毒素分子量均相對較小，多數(shù)聚集在25—28 kDa，其整體結(jié)構(gòu)是由外圍兩組單體α螺旋呈發(fā)夾狀環(huán)繞著中間多組反向平行的單體β折疊組成，主要用于防治鞘翅目和雙翅目害蟲（表1），尤其對公共衛(wèi)生領(lǐng)域傳播疾病的常見雙翅目媒介蚊蟲如按蚊（Anophelesspp.）、伊蚊、庫蚊（Culexspp.）具有極強的特異性毒殺活性[35]。這類毒素對靶標(biāo)害蟲的活性機制目前還不是很清晰，有觀點認為它們也存在與3D Cry 類型毒素類似的“穿孔形成模型”：原毒素進入靶標(biāo)害蟲腸道后，功能性蛋白酶對其N 端和C 端特異性位點進行水解形成活化態(tài)，進而與腸壁細胞膜上的卵磷脂、腦磷脂、鞘磷脂等飽和性膜脂表面活性受體互作，活化態(tài)毒素單體異構(gòu)聚集形成類似打開的傘狀多聚體結(jié)構(gòu)并由中心β折疊牽引橫穿插入膜脂，同時C 端裸露的單體α螺旋驅(qū)動毒素寡聚化與特異性膜蛋白受體強力互作，從而造成細胞膜通透性穿孔，誘發(fā)蟲體死亡；也有觀點認為，Cyt 家族毒素在對靶標(biāo)害蟲的毒殺活性過程是由于產(chǎn)生了類似于去垢劑的溶脂效應(yīng)，它們在腸道中被水解活化后特異性與腸壁細胞膜脂特異性受體互作，引起細胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)溶解坍塌，誘發(fā)蟲體死亡[34]。

1.3 Vip 家族毒素

Vip 家族毒素4 個亞類（Vip1—4）的基因序列特異性和靶標(biāo)害蟲作用受體均與Bt Cry 類型毒素存在明顯不同，Vip1（～100 kDa）/Vip2（～52 kDa）屬二元毒素，它們協(xié)同對半翅目和鞘翅目害蟲具有特異性毒性，而Vip3（～88 kDa）和Vip4（～108 kDa）則分別對部分鱗翅目害蟲和線蟲具有較強毒性。Vip1/Vip2 二元毒素協(xié)同作用靶標(biāo)害蟲過程，Vip1 被認為是受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域毒素，目前結(jié)構(gòu)尚不清晰，有推測認為其關(guān)鍵活性區(qū)域可能是由親水性殘基和疏水性殘基交替構(gòu)成的β-strand 結(jié)構(gòu)，當(dāng)毒素進入靶標(biāo)害蟲腸道后，經(jīng)蛋白酶水解活化，與腸壁細胞膜受體結(jié)合并形成單體寡聚化，造成細胞膜雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)超導(dǎo)化形成孔道[36]；而Vip2則被認為是細胞毒性結(jié)構(gòu)域毒素，其結(jié)構(gòu)與產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens）分泌的I 毒素（Iota toxin）類似，由外圍短螺旋結(jié)構(gòu)纏繞中心多組短折疊片層組成，其借助Vip1 造成的細胞膜孔道通過細胞內(nèi)吞作用進入細胞質(zhì)，從而干擾二磷酸腺苷核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，影響微絲肌動蛋白合成和組裝，造成細胞骨架裂解，誘發(fā)蟲體死亡[37]。Vip3 毒素如Vip3A、Vip3B 等一般是由5 個功能結(jié)構(gòu)域纏繞形成的四聚體，N 端主體為短螺旋結(jié)構(gòu)，是維持毒素蛋白穩(wěn)定和發(fā)揮殺蟲活性的功能區(qū)域，C 端主體則為短螺旋和卷曲的復(fù)合結(jié)構(gòu)，決定毒素對靶標(biāo)害蟲的特異性[38]；Vip3 毒素活性機制尚不明確，原毒素進入靶標(biāo)害蟲腸道后會被蛋白酶水解形成分子量為62—66 kDa 的活化態(tài)，推測認為其很可能是與中腸壁細胞膜上的某些特異性受體結(jié)合互作，造成相應(yīng)靶標(biāo)害蟲中腸細胞膜雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)離子通道滲透失衡，引發(fā)細胞空泡性腫脹穿孔直至裂解，也可能毒素同步通過細胞內(nèi)吞作用進入胞內(nèi)，造成溶酶體和線粒體DNA 損傷，從而啟動細胞凋亡或自噬程序，由此綜合誘發(fā)蟲體死亡[39]。Vip4 毒素是由N 端28 個氨基酸短信號肽連同兩個保守的功能結(jié)構(gòu)域組成，其在進化上與Vip1 毒素和二元毒素Bin-B 相對較近，目前發(fā)現(xiàn)其對鞘翅目害蟲玉米根蟲（Diabroticavirgifera）防治效果顯著[40]，但活性機制尚不清楚。

1.4 Sip 家族毒素

Sip 家族是目前發(fā)現(xiàn)的唯一對鞘翅目害蟲具有殺蟲活性的分泌型Bt 毒素，這類毒素的分子量在41 kDa左右，一般以包涵體形式分泌到細胞外，N 端存在一段具有革蘭氏陽性細菌典型特征的保守的分泌信號短肽（30 個氨基酸），關(guān)鍵活性區(qū)域存在多組典型的α螺旋、β折疊以及無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，其在進化上與ETX/MTX家族中的MTX3 毒素顯著相似，由此推測這類毒素對靶標(biāo)害蟲的活性機制可能屬于對中腸壁細胞膜形成β-barrel 穿孔類型[41]。

2 基于Bt 毒素的殺蟲蛋白理性設(shè)計

錨定Bt 毒素功能結(jié)構(gòu)域乃至關(guān)鍵活性位點，結(jié)合靶標(biāo)害蟲潛在關(guān)鍵受體互作信息和生測驗證，是理性設(shè)計基于Bt 毒素的殺蟲蛋白功能改造和功能模擬效應(yīng)物的核心依據(jù)，目前實現(xiàn)手段主要采用關(guān)鍵活性區(qū)域或位點突變、同源或異源功能性結(jié)構(gòu)域雜合以及全新的依托抗獨特型抗體功能模擬3 種方式。

2.1 基于Bt 毒素的突變體理性設(shè)計

突變是驅(qū)動Bt 毒素功能改進的最主要方式，事實上，Bt 毒素在自然條件下也會偶然發(fā)生功能進化性突變，如DANDAPAT 等[42]就發(fā)現(xiàn)在自然條件下Cry1Ab毒素Domain Iα7 區(qū)域223 位點氨基酸S 突變?yōu)镕，對靶標(biāo)害蟲水稻三化螟（Scirpophagaincertulus）的殺蟲活性提高近40%，這也為Bt 毒素特性功能修飾的突變體理性設(shè)計提供了很好例證。目前，基于Bt 毒素的殺蟲蛋白突變體理性設(shè)計，最主要目標(biāo)是改進其殺蟲活性，關(guān)注對象則聚焦在Cry 類型毒素上，其中核心重點是3D Cry 類型，此外Cyt、Vip、Sip 等類型毒素均有所涉及，代表性實例見表2。

表2 基于Bt 毒素的突變體理性設(shè)計實例Table 2 Examples of mutant rational design based on the Bt toxins

3D Cry 類型毒素各結(jié)構(gòu)域（Domain I/II/III）的結(jié)構(gòu)功能和對相關(guān)靶標(biāo)害蟲的作用機制相對較為明晰，這為其功能改造，特別是殺蟲活性改進上的理性設(shè)計創(chuàng)造了極為有利的條件。其中，對Domain Iα螺旋結(jié)構(gòu)中α2—α3[43-44]、α3—α4[45-47]、α4—α5[48]等關(guān)鍵功能位點進行定點突變，對Domain II Loop 結(jié)構(gòu)中Loop1[49]、Loop2[4,50-54]、Loop3[52,55]等關(guān)鍵功能區(qū)域進行定點突變，對Domain IIIβ折疊結(jié)構(gòu)中β16—β22[56-59]等關(guān)鍵功能區(qū)域進行定點突變，均能設(shè)計獲得相應(yīng)毒素殺蟲活性乃至紫外線照射降解耐受性[12]顯著提高的突變體。當(dāng)然，這種針對關(guān)鍵活性位點或關(guān)鍵功能區(qū)域的理性設(shè)計所產(chǎn)生的突變體的殺蟲活性并不都是正向提高，如Cry4Ba 毒素Domain Iα2 區(qū)域兩個位點氨基酸突變（D111K 或K115D）對靶標(biāo)害蟲埃及伊蚊的致死毒性幾乎完全喪失[60]，Cry4Aa 毒素Domain IIβ6—β7 之間的Loop2 區(qū)域428SCDNKYLNDYN438氨基酸突變?yōu)镵AQTTPN 或IPATYK 對靶標(biāo)害蟲尖音庫蚊（Culex pipiens）的致死毒性幾乎完全喪失[61]，Cry1Ab 毒素Domain II Loop3 區(qū)域3 個氨基酸突變（S441R/N442V/S446V）對靶標(biāo)害蟲煙草天蛾（Manducasexta）的致死毒性降低至原毒素的1.4%[62]。錨定關(guān)鍵活性位點或關(guān)鍵功能區(qū)域?qū)?D Cry 類型毒素進行定點突變，突變體與靶標(biāo)害蟲BBMV 或CAD、APN、ALP、ABC 轉(zhuǎn)運蛋白（ABCC2/ABCC3）等潛在關(guān)鍵受體的互作親和力是初步判定其殺蟲活性強弱的重要參考依據(jù)，因為包括突變體在內(nèi)的3D Cry 類型毒素的殺蟲活性往往與這些受體的親和力呈正相關(guān)關(guān)系，但并不是親和力越高殺蟲活性就一定越強[4,55]，靶標(biāo)害蟲生測仍然是判定突變體殺蟲活性的最終依據(jù)。

Cyt、Vip 和Sip 類型毒素盡管在結(jié)構(gòu)功能和對靶標(biāo)害蟲的活性機制上的信息相對較少，但對其定向突變改造也取得了一定成效。目前，Cyt 類型毒素的定點突變改造主要是圍繞Cyt1/Cyt2 的Loop 區(qū)域進行定點突變或肽段突變替換，如Cyt1Aa Loop6-αE 區(qū)域204 位點氨基酸突變（E204A）[63]、Cyt1Aa Loop6/7/9 替換突變?yōu)橥吹腃ry1Ab 毒素Loop3 區(qū)肽段[64]、Cyt2Aa 替換突變?yōu)楫愒吹耐愣寡粒ˋcyrthosiphonpisum）腸道結(jié)合肽肽段[65]，從而增強原毒素對靶標(biāo)害蟲的殺蟲活性；Vip 類型毒素的定點突變改造集中在Vip3A 的Domain I[66]、II[67]、IV[68]和V[69]等區(qū)域，獲得的突變體對靶標(biāo)害蟲的致死毒力普遍提高2—8 倍，其中設(shè)計對Vip3A Domain V 區(qū)域776 位點氨基酸突變（N776Y）后對靶標(biāo)害蟲甜菜夜蛾（Spodopteraexigua）的致死毒力不僅提高2.27 倍，而且毒素蛋白在37 ℃條件下保持活性由1 個月延長至3 個月，熱穩(wěn)定性顯著增強[70]；而Sip 類型毒素的定點突變改造現(xiàn)僅涉及Sip1Aa 毒素的128 位點氨基酸（K128A）、153 位點氨基酸（G153C）、248位點氨基酸（H248C）突變，相應(yīng)突變體對靶標(biāo)害蟲白菜葉甲（Colaphellusbowringi）的致死毒力提高2—10倍[41,71]。

2.2 基于Bt 毒素的結(jié)構(gòu)域雜合體理性設(shè)計

基于結(jié)構(gòu)功能特性是理性設(shè)計Bt 毒素功能改進的雜合體的關(guān)鍵依據(jù)，通過針對性引入同源的異種Bt毒素或異源的其他殺蟲蛋白進行特定結(jié)構(gòu)域替換、重組、融合，從而實現(xiàn)殺蟲活性更強、殺蟲譜更廣乃至可抵御靶標(biāo)害蟲抗藥性的新型Bt 毒素雜合體的構(gòu)建創(chuàng)制；目前相關(guān)研究以結(jié)構(gòu)功能較為明晰的3D Cry類型毒素間的結(jié)構(gòu)域雜合或其與其他類型殺蟲蛋白雜合為主，此外也涉及個別Vip 類型毒素的雜合改造，代表性實例見表3。

表3 基于Bt 毒素的結(jié)構(gòu)域雜合體理性設(shè)計實例Table 3 Example of domain hybrid rational design based on Bt toxins

Domain I 是3D Cry 類型毒素發(fā)揮殺蟲功能的關(guān)鍵區(qū)域，錨定該區(qū)域進行結(jié)構(gòu)域替換是獲得更高殺蟲雜合體的可行手段，如SHAH 等[80]將對棉鈴蟲幾乎無殺蟲活性的Cry9Aa Domain I替換為對該蟲具高致死活性的Cry1Ac Domain I，創(chuàng)制的雜合體對棉鈴蟲的致死毒力較Cry1Ac 毒素還提高4.9 倍；而HU 等[81]則將Cry2A Domain I 替換為與其基因同源性（41.5%）相近的異源殺蟲蛋白PirB toxin，所產(chǎn)生的雜合體對草地貪夜蛾的致死毒力提高2.41 倍。Domain II/III 共同決定3D Cry類型毒素作用靶標(biāo)害蟲的類型，其中Domain II 在進化上相對較為保守，目前針對該結(jié)構(gòu)域的替換研究較少，而Domain III 則不僅是維持活化態(tài)毒素穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)域，其在進化上也是3 個功能結(jié)構(gòu)域中最為活躍的區(qū)域[82]，因此針對該結(jié)構(gòu)域的雜合改造是關(guān)注的重點，相關(guān)功能改進成功的研究較多（表3）。如依托同源的異種Bt 毒素進行雜合的策略中，Cry1Ac[83]、Cry1Ba[84]、Cry1Ca[85]的Domain III 分別替換為Cry1Ca、Cry1Ca和Cry1Ac 的Domain III 所產(chǎn)生的雜合體對相應(yīng)靶標(biāo)害蟲的致死毒力提高數(shù)十倍乃至上百倍，Cry1Gb Domain III 替換為Cry1Ig 的Domain III 所產(chǎn)生的雜合體則對Bt毒素耐藥性草地貪夜蛾具有強致死活性，有望成為相應(yīng)害蟲抗性治理的優(yōu)質(zhì)材料；而依托異源的其他殺蟲蛋白進行雜合的策略中，供雜合的殺蟲蛋白結(jié)構(gòu)功能同樣是用于Bt 毒素改進的重要依據(jù)，典型的如具殺蟲功能的大蒜凝集素與Cry1Ac Domain III 在折疊結(jié)構(gòu)和受體識別結(jié)合上具有一定相似性，因此以其替換Domain III結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的雜合體對靶標(biāo)害蟲中腸受體結(jié)合能力得到增強，從而提高對蟲體的致死毒力[86]。除了單個功能結(jié)構(gòu)域替換雜合外，多結(jié)構(gòu)域雜合也是Bt 毒素功能改進的重要手段，而這種策略有望集成母體毒素殺蟲活性和靶標(biāo)害蟲特異性等多重優(yōu)勢，因此在擴大毒素蛋白殺蟲譜、提高毒素穩(wěn)定性甚至是抗藥性害蟲治理上具有獨特優(yōu)勢，如將Cry1Ac 前體肽、Cry1Ah Domain I、Cry1Ac Domain II 和Cry1Ca Domain III 組裝所產(chǎn)生的雜合體對鱗翅目害蟲的殺蟲譜更廣[13]；Cry1Be Domain I-II、Cry1Ca Domain III 和Cry1Ab C 端晶體穩(wěn)定肽（Domain 4—7）組裝所產(chǎn)生的雜合體對草地貪夜蛾Bt 抗性品系具有顯著致死活性；Cry1Ab Domain I、Cry1Ac Domain II、Cry1F Domain III、Cry1Ab C 端晶體穩(wěn)定肽（Domain 4—7）組裝所產(chǎn)生的雜合體對玉米螟的致死毒力較3種母本供體提高8—11 倍[87]，同時熱穩(wěn)定性也較3 種母本供體更強[88]。此外，非結(jié)構(gòu)域雜合的“Bt-Bt”或“Bt-其他殺蟲蛋白”基因融合形成全新的復(fù)合物雜合體策略，也是改進Bt 毒素功能的可行手段，如Cry1Ac C 端肽段與Cry4Ba N 端融合[89]或N 端與Ricin B-chain lectin 融合[90]、Vip3Aa C 端與Cry1Ac N 端片段融合[91]或N 端與PCx 基因融合[92]，甚至借助Bt 毒素部分結(jié)構(gòu)融合具殺蟲功能的蛋白酶抑制劑[93]等形成的復(fù)合雜合體均對相應(yīng)靶標(biāo)害蟲的殺蟲活性有顯著提升。

2.3 基于Bt 毒素的功能模擬效應(yīng)物理性設(shè)計

設(shè)計抗體模擬包括化學(xué)農(nóng)藥、生物農(nóng)藥在內(nèi)的抗原關(guān)鍵結(jié)構(gòu)乃至生物功能的效應(yīng)物是農(nóng)藥免疫檢測和農(nóng)藥新材料研發(fā)的新興領(lǐng)域，該路徑以抗體免疫網(wǎng)絡(luò)理論為依據(jù)，認為具備獨特型抗原識別結(jié)合特性的獨特型抗體（idiotype antibody，也稱為Ab1）在機體內(nèi)也會充當(dāng)“抗原”角色逆向刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生該獨特型抗體的抗體即“抗抗體（Ab2）”，并持續(xù)誘發(fā)級聯(lián)免疫反應(yīng)直至動態(tài)穩(wěn)定到逐漸結(jié)束，該過程中由Ab1 分子上的獨特型抗原受體部位刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對該獨特型抗原受體骨架區(qū)的抗抗體（Ab2α）、針對互補決定區(qū)的抗抗體（Ab2β）、針對靠近互補決定區(qū)的抗抗體（Ab2γ）和針對遠離互補決定區(qū)的抗抗體（Ab2ε）4種類型的抗獨特型抗體（anti-idiotype antibody，Anti-Id），其中Ab2βAnti-Id 直接由獨特型抗原受體部位與獨特型抗原發(fā)生互作的關(guān)鍵核心區(qū)域即互補決定區(qū)所誘導(dǎo)產(chǎn)生，從而與獨特型抗原形成互為內(nèi)影像效應(yīng)，因此在一定程度上具備模擬抗原部分結(jié)構(gòu)乃至生物功能的特性[14]。基于這一特性，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域可設(shè)計制備模擬相關(guān)藥物的功能替代效應(yīng)物用于疾病治療，如催乳素[106]、萬古霉素[107]等均有相應(yīng)功能模擬效應(yīng)物（Ab2βAnti-Id）創(chuàng)制成功的報道；在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，SHI等[108]通過動物免疫誘導(dǎo)獲得了可模擬玉米赤霉烯酮特征構(gòu)象的單克隆Ab2βAnti-Id；WANG 等[109]借助噬菌體展示抗體庫篩選設(shè)計獲得了可模擬黃曲霉毒素特征構(gòu)象的基因工程Ab2βAnti-Id，均可替代原毒素標(biāo)準品建立免疫檢測方法用于農(nóng)產(chǎn)品中相應(yīng)毒素檢測。作者團隊近年來則依托Ab2βAnti-Id 具有模擬抗原構(gòu)象乃至生物功能的這一特性，以從劍橋大學(xué)蛋白質(zhì)工程中心引進的高質(zhì)量人源化噬菌體展示抗體庫：Tomlison I+J 單鏈抗體（single chain variable fragment，scFv）庫，庫容量分別為1.47×108和1.37×108pfu/mL；DAb 重鏈單域抗體庫：庫容量為3.0×109pfu/mL；以及自構(gòu)建的鼠源、兔源等免疫偏向噬菌體展示抗體庫等為庫源材料，設(shè)計Bt 毒素抗體（單克隆抗體/多克隆抗體）或其關(guān)鍵功能片段（如Fab）為固相化包被靶點“抗原”，通過“抗原包被-洗滌-封閉-洗滌-庫投入-結(jié)合吸附-洗滌-酶切洗脫-侵染擴增”等步驟多輪循環(huán)富集淘篩，獲得的陽性單克隆噬菌體展示抗體經(jīng)與相應(yīng)Bt 毒素競爭抑制及與相應(yīng)靶標(biāo)害蟲中腸BBMV 或CAD、APN、ALP、ABCC2 等潛在關(guān)鍵受體結(jié)合互作等多重分析鑒定[110]，從而獲得符合Ab2βAnti-Id 特征的陽性克隆，并結(jié)合靶標(biāo)害蟲生測驗證結(jié)果，最終確定具模擬Bt 毒素殺蟲功能的目標(biāo)效應(yīng)物抗體（Ab2βAnti-Id）。團隊前期以3D Cry 類型毒素為重點模擬對象，現(xiàn)已初步實現(xiàn)涵蓋具備模擬Cry1Aa,b,c/1B/1C/1F/2Aa 等類型在內(nèi)的Bt 毒素殺蟲功能的新型殺蟲功能效應(yīng)物抗體靶向設(shè)計，相關(guān)功能模擬效應(yīng)物材料在結(jié)構(gòu)特點上與模擬對象的部分關(guān)鍵活性區(qū)域存在一定相似性，且對供試的小菜蛾、棉鈴蟲、稻縱卷葉螟等靶標(biāo)害蟲的致死率達到相應(yīng)原Bt 毒素的23.3%—77.87%[14]，具有重要的科學(xué)研究意義和潛在應(yīng)用價值。

3 基于Bt 毒素的殺蟲蛋白創(chuàng)新應(yīng)用策略

推進Bt 毒素創(chuàng)新應(yīng)用模式是實現(xiàn)其殺蟲活性或穩(wěn)定性等功能增效乃至靶標(biāo)害蟲抗藥性治理的重要手段，目前主要策略包括催化毒素活化、驅(qū)動毒素靶向受體結(jié)合、促進毒素表達以及同源或異源殺蟲材料復(fù)配或共表達的協(xié)同促效等，代表性實例見表4。

表4 基于Bt 毒素的抗蟲增效應(yīng)用創(chuàng)新策略Table 4 Innovative application strategy of insecticide enhancement based on Bt toxins

催化毒素活化增效策略目前主要依托鈣黏蛋白功能片段[111]、類鈣黏蛋白功能片段[112]為增效物，它們通過催化毒素（3D Cry 類型）活化態(tài)寡聚化，極大提升毒素與靶標(biāo)害蟲中腸受體結(jié)合的效率和強度，從而助推毒素殺蟲增效；此外，大腸桿菌maltose binding protein（MBP）也能通過調(diào)控靶標(biāo)害蟲腸道功能酶活性，促進Bt（Cry8Hb/Cry3-type）原毒素非活性晶體結(jié)構(gòu)溶解并快速釋放活化態(tài)[113]，也是助推毒素殺蟲活性的重要增效物。而驅(qū)動毒素靶向受體結(jié)合增效策略主要是借助如蘇云金芽孢桿菌輔助蛋白P20 helper protein[19]、小菜蛾伴侶蛋白PxHsp90 chaperone protein[18]等特殊功能蛋白具備介導(dǎo)牽引Bt 毒素靶向結(jié)合害蟲中腸受體的特性，或借助如芽孢桿菌類增強蛋白 enhancin-like protein[114]具備干擾害蟲腸道保護酶的特性，助推相應(yīng)毒素與中腸受體高效互作，從而引發(fā)毒素殺蟲增效。表達增效則主要是通過促進Bt 毒素在工程菌或轉(zhuǎn)基因作物中的表達量從而增強相應(yīng)菌劑或轉(zhuǎn)基因作物對靶標(biāo)害蟲的殺蟲活性，目前可行策略包括借助高效表達載體如源于蘇云金芽孢桿菌的QBT220-pBtoxis plasmid[115]、強啟動子如源于蘇云金芽孢桿菌的Prsi[116]和源于棉花卷葉病毒的CLCuKoV-Bu[117]、調(diào)控表達的內(nèi)含子如源于玉米的ubi1[118]，甚至是如固氮菌Azotobacter[119]、氨基酸[120]或多肽[20]等促生長或表達的共生菌或其他類似肥料功效的材料，均能提升目標(biāo)毒素在相應(yīng)工程菌或轉(zhuǎn)基因作物中不同程度的表達增效。此外，借助噬菌體或核糖體展示表達，幫助Bt 毒素轉(zhuǎn)錄表達過程正確折疊，也能增強毒素對靶標(biāo)害蟲的致死活性[121]。這些增效策略的共同點是涉及的增效物本身對供試靶標(biāo)害蟲并不具備殺蟲活性，它們在對Bt 毒素的增效作用中扮演著類似催化劑、介導(dǎo)劑或表達調(diào)節(jié)劑的角色。

依托同源或異源殺蟲材料對Bt 毒素殺蟲功能協(xié)同促效的創(chuàng)新策略類似于化學(xué)農(nóng)藥聯(lián)合復(fù)配增效，是推進Bt 毒素殺蟲活性乃至穩(wěn)定性的較為快捷有效手段，相關(guān)策略較多（表4）。同源復(fù)配或共表達增效策略，主要是利用不同Bt 毒素類型部分功能結(jié)構(gòu)域相似[122]的特征或不同Bt 毒素類型對相同靶標(biāo)害蟲存在不同作用受體[123]或?qū)Σ煌袠?biāo)害蟲存在相同或類似作用受體[124-126]的特性，通過復(fù)配或共表達實現(xiàn)供試毒素殺蟲活性協(xié)同增強或害蟲抗藥性治理的目的。其中，較為典型的如Cry1Ca[127]、Cry4Aa[128]、Cry4Ba[21]、Cry 10Aa[128]、Cry11Aa[129]、Cry11Ba[130]等3D Cry 類型毒素與Cyt 類型毒素正向或反向互為增效物的聯(lián)合應(yīng)用對蚊蟲等雙翅目靶標(biāo)害蟲的增效作用非常明顯，致死毒力普遍較相應(yīng)毒素單獨使用提高1.19—71.0 倍；而Cry9Aa[131]、Cry9Ee[132]以Vip3Aa 增效物或Vip3Aa[133]以Cry1F 和Cry1Ie 為增效物，對相應(yīng)靶標(biāo)害蟲的致死毒力較各毒素單獨使用提高1.1—287.76 倍；此外，Cyt1Aa 以Bt 毒素同源的BinA 毒素為增效物，對Cyt1Aa 抗藥性致倦庫蚊（Culexquinquefasciatus）幼蟲的致死毒力提高近5 倍[134]，這種增效策略在相應(yīng)害蟲抗藥性治理上具有獨特優(yōu)勢。而以異源殺蟲材料對Bt 毒素殺蟲功能協(xié)同促效的增效策略，則在形式上更加多樣、機理上也更為復(fù)雜。在增效物選擇上，主要利用具殺蟲功能的如幾丁質(zhì)酶、凝集素、蛋白酶抑制劑以及防御素等通過抑制靶標(biāo)害蟲腸道胰蛋白酶、V-ATP酶、α-淀粉酶、半胱氨酸蛋白酶、α-糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等與消化吸收相關(guān)的功能酶的特性[135]，或如蜘蛛毒素、海葵毒素等殺蟲短肽通過干擾靶標(biāo)害蟲腸道細胞鈉、鈣、鉀等離子通道或抑制功能性門控通道蛋白（如煙堿乙酰膽堿受體）引起蟲體神經(jīng)興奮性麻痹毒性的特性[136]，協(xié)同Bt 毒素對靶標(biāo)害蟲產(chǎn)生毒力疊加的增效效應(yīng)。此外，源于真菌的阿維菌素[137]、源于植物提取物的芥子油[138]和黃酮[139]甚至是活體菌球孢白僵菌（Beauveriabassiana）[140]、嗜線蟲致病桿菌（Xenorhabdusnematophila）[141]、多角體病毒（Autographa californica multiple nuclearpolyhedrosis virus，AcMNPV）[142-143]以及具備RNA 干擾（RNA interference，RNAi）功能的特異性dsRNA[144]等具殺蟲功能的生物材料均能作為增效物，在一定程度上直接或間接增強Bt 毒素對特定靶標(biāo)害蟲的致死毒力。值得一提的是，最近報道的一些諸如源于嗜線蟲致病桿菌的Txp40（42 kDa）[145]、源于蒙氏假單胞菌（Pseudomonas monteilii）的Mpf2Ba1（53 kDa）[146]、源于發(fā)光桿菌（Photorhabdusakhurstii）的TcaB（63 kDa）[147]等與Bt 毒素功能結(jié)構(gòu)或殺蟲活性機制上具有一定相似之處的新型殺蟲蛋白，理論上也具備協(xié)同Bt 毒素對共同靶標(biāo)害蟲毒力增效的潛力，相關(guān)研究值得推進。

4 結(jié)語與展望

自20 世紀初，Bt 毒素具備特異性防治害蟲的功能被發(fā)現(xiàn)并加以利用以來，其在農(nóng)業(yè)、林業(yè)乃至公共衛(wèi)生等領(lǐng)域中的害蟲防治發(fā)揮了巨大作用，在世界范圍內(nèi)掀起了一場害蟲防治的綠色革命，帶來了巨大的經(jīng)濟價值和社會生態(tài)效益。Bt 毒素作為源于微生物的大分子蛋白類殺蟲材料，其對常見農(nóng)林害蟲和公共衛(wèi)生病毒媒介蚊蟲的特異性廣譜高毒殺活性以及對非靶標(biāo)生物特別是人類的高度安全性等方面的得天獨厚的優(yōu)勢，是其他綠色殺蟲材料所無法比擬的，無論是過去、現(xiàn)在還是可預(yù)見的未來相當(dāng)時間內(nèi)，圍繞Bt 毒素靶向增強穩(wěn)定性、提升殺蟲活性、擴大殺蟲譜、提高非靶標(biāo)生物安全性乃至害蟲抗藥性治理等方向的殺蟲蛋白理性設(shè)計與創(chuàng)新應(yīng)用仍然是害蟲綠色防治領(lǐng)域競相追逐的持久性熱點。

基于Bt 毒素的殺蟲蛋白理性設(shè)計方面，錨定活性位點氨基酸的突變改造策略尤其在高效改進Bt 毒素殺蟲活性上具有顯著優(yōu)勢，個別毒素的特定位點突變不僅擴大殺蟲譜還能降低對非靶標(biāo)生物的毒性甚至增強熱穩(wěn)定性或增強對紫外線的耐受穩(wěn)定性，但這種策略目前尚無法有效應(yīng)對靶標(biāo)害蟲抗藥性問題；而結(jié)構(gòu)域雜合策略則取長補短，具備定向集成了不同Bt 毒素關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域特征或其他殺蟲蛋白特定功能特性的優(yōu)勢，這種策略不僅在增強毒素殺蟲活性上較為有效，同時在擴大殺蟲譜、增強穩(wěn)定性甚至應(yīng)對害蟲抗藥性等方面均具有獨特優(yōu)勢。這兩種策略是Bt 毒素理性設(shè)計的傳統(tǒng)經(jīng)典方式，創(chuàng)制出的殺蟲蛋白均屬于性能加強版的Bt 毒素，在靶標(biāo)害蟲防治上具有更強的實用性和適用性。基于Ab2βAnti-Id 理論的Bt 毒素抗蟲功能模擬效應(yīng)物理性設(shè)計，是一種全新的殺蟲蛋白靶向創(chuàng)新創(chuàng)制策略，以抗體模擬Bt 毒素殺蟲功能，在害蟲防治應(yīng)用上由于模擬物的抗體屬性，理論上對非靶標(biāo)生物特別是對人類和高等級動物較原Bt 毒素更具安全性上的優(yōu)勢；同時該技術(shù)路徑不局限于Bt 毒素殺蟲功能模擬物創(chuàng)制，理論上也適用于所有蛋白類殺蟲材料的功能模擬物設(shè)計，有望成為害蟲綠色防治新材料創(chuàng)制上的新捷徑。目前，該設(shè)計策略尚處于室內(nèi)的起步探索階段，相關(guān)Bt 毒素殺蟲功能模擬物對供試靶標(biāo)害蟲的致死毒力僅達到原毒素的23.3%—77.9%[14]，在應(yīng)用上仍有很大差距。不過這種策略創(chuàng)制的殺蟲模擬物本質(zhì)上仍然屬于抗體，具備較為完整的抗體關(guān)鍵功能分區(qū)結(jié)構(gòu)，因此當(dāng)前成熟的抗體體外親和成熟技術(shù)如定點突變、鏈置換、易錯PCR 等均適用于這些模擬物殺蟲功能的進一步修飾改造，如作者團隊XIE 等[175]采用鏈置換技術(shù)將Cry1Ac 和Cry1B抗蟲模擬物單鏈抗體的輕鏈重組并進一步點突變改造，形成的雜合突變體對靶標(biāo)害蟲小菜蛾的致死率提高了近40%，這些技術(shù)有望推進Bt 毒素殺蟲功能模擬物抗體甚至超過原Bt 毒素的應(yīng)用價值，值得深入探究。

基于Bt 毒素的殺蟲蛋白創(chuàng)新應(yīng)用方面，采用催化毒素活化和驅(qū)動毒素靶向受體結(jié)合的策略促進供試毒素對靶標(biāo)害蟲的致死毒力或致死效率，主要得益于對相應(yīng)毒素結(jié)構(gòu)功能與作用機制的解析，兩種策略中的增效物具有鮮明的特定毒素類型靶向增效的特性，是助推Bt 毒素應(yīng)用價值的重要輔助手段；而促進毒素表達以及同源或異源殺蟲材料復(fù)配或共表達的協(xié)同促效策略，尤其在靶標(biāo)害蟲高效防治上的效果普遍較為明顯，這也是當(dāng)前包括Bt 毒素在內(nèi)的幾乎所有蛋白類殺蟲材料在增強害蟲防治效果的創(chuàng)新應(yīng)用中極為實用的最主要手段，不僅如此，這些策略對增強毒素穩(wěn)定性、擴大殺蟲譜以及害蟲抗藥性治理等方面也同樣具有優(yōu)勢，特別是Bt 毒素正面臨日趨嚴峻的害蟲抗藥性壓力，采用生物或化學(xué)類抗蟲材料協(xié)同其應(yīng)對害蟲抗藥性的策略是當(dāng)前害蟲抗性治理最行之有效的不二選擇，可探索創(chuàng)新應(yīng)用的空間巨大。此外，探索物理增效法也能在一定程度上促進Bt 毒素活性，如將表達Bt 毒素的蘇云金芽孢桿菌孢子粉末研磨處理（顆粒由105 μm 降至210—1 171 nm）對斜紋夜蛾的致死毒力提高1.51 倍[176]；借助atmospheric and room temperature plasma（ARTP）/nitrosoguanidine（NTG）對表達Bt毒素（Cry1/Cry2Aa/Vip3Aa）的蘇云金芽孢桿菌X023PN（BtX023PN）進行雙重誘變，突變體對小菜蛾和東方黏蟲的致死毒力提高2.33 和2.13 倍，且菌體中Cry1Ac 表達量增加61%[177]；甚至Bt 毒素某些特殊結(jié)構(gòu)也能反向作為增效物，促進其他殺蟲材料對靶標(biāo)害蟲的致死活性，如將Cry11Aa domain II loopα8/Cyt1Aa loopβ6-αE 肽段導(dǎo)入Aedesaegyptidensovirus（AeDNV）病毒中，能顯著增強病毒對埃及伊蚊幼蟲的致死毒力[178]。更值得注意的是，植物內(nèi)生菌作為健康植株生活史過程不可或缺的共生菌，以其作為生防載體搭載外源功能性殺蟲或殺菌蛋白，通過定殖宿主農(nóng)作物，相應(yīng)蛋白隨菌體在植株體內(nèi)共轉(zhuǎn)錄表達和遷移蓄積，由此可以達到協(xié)同宿主作物防治病蟲害的目的，如DOWNING 等[179]、ZHANG 等[180]以植物內(nèi)生菌為生防載體分別搭載具備抗大豆根腐病（病原菌為立枯絲核菌Rhizoctoniasolani）功能的幾丁質(zhì)酶和具備抗水稻白背飛虱（Sogatellafurcifera）功能的半夏凝集素，構(gòu)建的重組生防工程菌直接定殖相應(yīng)農(nóng)作物后均可協(xié)同宿主植株防治靶標(biāo)病蟲害。這種以植物內(nèi)生菌搭載功能性蛋白材料定殖宿主作物協(xié)同防治靶標(biāo)病蟲害的創(chuàng)新應(yīng)用策略，有望推動蛋白類抗病蟲害材料避開在制劑表達及產(chǎn)品維持活性穩(wěn)定上的困境，也能跳過其轉(zhuǎn)基因作物改造過程的復(fù)雜技術(shù)流程且在不改變宿主作物其他性狀的前提下達到與其轉(zhuǎn)基因作物類似的抗病蟲害功效[135]，目前尚無Bt 毒素的相關(guān)研究和應(yīng)用，依托該策略，未來有望實現(xiàn)Bt 毒素及基于Bt 毒素的新型殺蟲蛋白在靶標(biāo)害蟲防治上突破傳統(tǒng)制劑或轉(zhuǎn)基因方式邁向更為綠色有效的創(chuàng)新應(yīng)用模式，具有重要的探索價值和科學(xué)研究意義。