普通小麥Arableu#1 白粉病成株抗性遺傳解析

李子萌，袁嬋，張宇慶，任妍，劉鵬鵬，嚴(yán)珊珊，襲夢(mèng)涵，穆培源，蘭彩霞?

1 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/湖北洪山實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，武漢 430072；3 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，鄭州 450002；4 新疆農(nóng)墾科學(xué)院作物研究所，新疆石河子 832000

0 引言

【研究意義】小麥?zhǔn)鞘澜缟戏植挤秶顝V、播種面積最大、貿(mào)易量最大的糧食作物，為全球約40%的人口提供主食[1]。中國(guó)是世界上重要的小麥生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，確保小麥產(chǎn)量穩(wěn)定對(duì)我國(guó)糧食安全具有重要意義（國(guó)家統(tǒng)計(jì)局 2021）。小麥白粉病是由小麥布氏禾谷白粉菌（B.graminisf.sp.tritici）引起的氣傳真菌性病害[2]。在我國(guó)，白粉病年均發(fā)生面積在600 萬(wàn)hm2以上，小麥產(chǎn)量損失為5%—20%。目前，小麥白粉病在全國(guó)二十余省市均有發(fā)生，其中，危害嚴(yán)重且發(fā)生普遍集中在西南三省麥區(qū)、長(zhǎng)江中游麥區(qū)和黃淮海麥區(qū)。大量研究與生產(chǎn)實(shí)踐表明，培育和推廣抗病小麥品種是最經(jīng)濟(jì)有效且綠色環(huán)保的防治措施[3]。【前人研究進(jìn)展】小麥的抗病性主要有兩類(lèi)：一類(lèi)是垂直抗性，又稱(chēng)生理小種專(zhuān)化抗性、苗期抗性、全生育期抗性或主效基因抗性，該類(lèi)抗病基因往往具有NBS-LRR結(jié)構(gòu)域，隨著新的病原菌生理小種出現(xiàn)，其抗病性不穩(wěn)定、不持久[4-5]。另一類(lèi)是水平抗性，又稱(chēng)非小種專(zhuān)化抗性、成株抗性、高溫成株抗性、慢病性或部分抗性，往往由多個(gè)微效基因控制，苗期表現(xiàn)為感病癥狀，成株期的嚴(yán)重度低或病害發(fā)展緩慢，品種的抗病更穩(wěn)定、更持久[6]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外在白粉病抗源收集和新基因鑒定等方面開(kāi)展了大量研究，取得了一系列成果并應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。截至目前，國(guó)際上正式命名的抗白粉病基因已超過(guò)100 個(gè)，即Pm1—Pm69，近200個(gè)白粉病抗性QTL 被報(bào)道。其中，絕大多數(shù)基因?qū)儆谛》N專(zhuān)化全生育期抗性基因，少部分是成株抗性基因或高溫成株期抗性基因，目前僅3 個(gè)基因表現(xiàn)為兼抗多種病害（又稱(chēng)PAPR），即Lr34/Yr18/Sr57/Pm38、Lr46/Yr29/Sr58/Pm39和Lr67/Yr46/Sr55/Pm46[7-9]。生產(chǎn)中，大面積種植單一小麥品種致使白粉菌在較大的病害選擇壓力下出現(xiàn)高度變異性，多數(shù)主栽品種失去抗性。如今在我國(guó)小麥推廣品種中，僅少數(shù)幾個(gè)抗病基因如Pm4、Pm21、Pm24、Pm35等苗期基因和Pm38、Pm39、Pm46、Pm48、Pm52等成株抗性基因仍然發(fā)揮著作用[10-11]。研究表明，將PAPR 基因與小麥中其他微效基因或QTL 相結(jié)合，可以顯著提高小麥的抗病性[12]，對(duì)培育持久兼抗小麥新品種具有極高的應(yīng)用價(jià)值。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的開(kāi)發(fā)和不斷完善，二代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）被廣泛用于動(dòng)植物遺傳研究[13-14]。基因分型測(cè)序（genotyping-by-sequencing，GBS）是一種利用限制性?xún)?nèi)切酶降低靶向序列復(fù)雜性，通過(guò)測(cè)序產(chǎn)生高通量分子標(biāo)記的基因分型技術(shù)平臺(tái)[15-16]，即使在沒(méi)有參考基因組序列或其他已知序列信息的情況下，仍可產(chǎn)生數(shù)以萬(wàn)計(jì)的分子標(biāo)記[17-18]。ELBASYONI 等[19]已證實(shí)在基因組預(yù)測(cè)的應(yīng)用中，前期研究表明，基于GBS 技術(shù)獲得的單堿基多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism，SNP）標(biāo)記比芯片測(cè)序獲得的SNP 所得到的結(jié)果更精準(zhǔn)。GBS 已經(jīng)逐步遍及復(fù)雜基因組動(dòng)植物基因定位、關(guān)聯(lián)分析及基因組輔助育種中，成為簡(jiǎn)單且穩(wěn)定有效的工具[20]。【本研究切入點(diǎn)】培育抗病品種是防治小麥白粉病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑之一，但生產(chǎn)中由于大面積種植單一小麥品種，致使白粉菌加速產(chǎn)生新小種和優(yōu)勢(shì)小種，導(dǎo)致多數(shù)主栽品種失去抗性，給小麥白粉病的防治帶來(lái)嚴(yán)重威脅。因此，加強(qiáng)抗性資源的深入挖掘和加快抗性機(jī)理的遺傳解析成為當(dāng)下的研究重任。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】由CIMMYT 培育的普通小麥品系A(chǔ)rableu#1 在苗期高感白粉病，而成株期則表現(xiàn)出高度抗性，本研究利用雙親遺傳群體，通過(guò)多年多點(diǎn)田間表型和基因型分析，發(fā)掘該品系調(diào)控白粉病成株抗性QTL，篩選聚合多個(gè)抗病位點(diǎn)/基因的家系，予以豐富我國(guó)小麥種質(zhì)資源抗性來(lái)源，為育種家在短期內(nèi)選育持久抗病小麥新品種提供有效分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 供試材料

Apav#1（GID 1853706）是來(lái)自Avocet-YrA×Pavon 76 雜交后代中的一個(gè)家系，其在全生育期對(duì)葉銹病、條銹病、白粉病和稈銹病均表現(xiàn)為高感。Arableu#1（GID 7210108）在苗期時(shí)對(duì)上述4 種病害表現(xiàn)為感病，而在成株期則為近免疫抗性，其系譜為：Attila/3×Bacanora×2//Baviacora92/3/Kiritati/Weebil#1/4/Danphe，該品系由國(guó)際玉米小麥改良中心（CIMMYT）選育，于2018 年在埃塞俄比亞被正式審定并推廣。CIMMYT 前期將高感白粉病的春小麥品系A(chǔ)pav#1 與Arableu#1 雜交，構(gòu)建了一個(gè)含有142 個(gè)家系的F5重組自交系（recombination inbred line，RIL）群體。

本研究所用到的自然群體由570 份世界各地收集的小麥品種/品系構(gòu)建，涵蓋了主要小麥生產(chǎn)國(guó)的育成品種和地方品種，其中，我國(guó)小麥品種共計(jì)288份，國(guó)外材料共計(jì)282 份，包含141 份CIMMYT 育種材料。

1.2 F5 RIL 群體構(gòu)建

所需群體由CIMMYT 構(gòu)建而成，采用改良版混合選擇法構(gòu)建重組自交系群體，即選用感病親本Apav#1 與抗病親本Arableu#1 雜交獲得F1，將F1雜交種點(diǎn)播，成熟后取3 個(gè)獨(dú)立單株；由這3 個(gè)獨(dú)立單株獲得的F1種子分別播種3 行，行長(zhǎng)30 m，點(diǎn)播，成熟期每株收獲一個(gè)穗子，來(lái)自同一個(gè)F1單株的穗子混收混脫，獲得F2。同樣方法獲得F3和F4。F4點(diǎn)播后，成熟期拔單株獲得F5重組自交系群體。為了避免感病植株在加代過(guò)程中丟失，在群體加代的過(guò)程中，需要使用殺真菌劑進(jìn)行病害防治，確保感病植株可以正常生長(zhǎng)并繁衍，進(jìn)而不影響基因型分布頻率。

1.3 苗期白粉病溫室鑒定

1.4 成株期田間接種與表型調(diào)查

親本及相關(guān)遺傳群體分別于2019 年和2020 年在河南新鄉(xiāng)和武漢兩地進(jìn)行田間種植，雙行區(qū)，行長(zhǎng)0.7 m，行寬0.3 m，2 次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。每行播種3—5 g 種子（約60 株植株），與行垂直的方向播種一行京雙16 作感病誘發(fā)行。于兩葉期用白粉菌大田混合菌株進(jìn)行接種，當(dāng)高感材料Apav#1的病害嚴(yán)重度約為80%時(shí)，進(jìn)行第一次病害調(diào)查鑒定和記錄，約一周后，進(jìn)行第二次病害調(diào)查鑒定和記錄。自然群體于2021 年在河南省新鄉(xiāng)市中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院新鄉(xiāng)綜合實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行播種，種植方式同上，當(dāng)感病材料病害嚴(yán)重度約為80%時(shí)，進(jìn)行病害調(diào)查鑒定和記錄。

病害嚴(yán)重度的記錄參考改良的“Cobb’s Scale”標(biāo)準(zhǔn)[21]，根據(jù)病原菌孢子侵染葉片的面積比，最低記為“0”，最高記為“100”。采用BJARKO 和LINE 提出的方法計(jì)算病程曲線面積（area under the disease progress curve，AUDPC）[22]。

1.5 遺傳連鎖群構(gòu)建與QTL 定位

試驗(yàn)材料的基因型數(shù)據(jù)前期已由CIMMYT 的基因型分析技術(shù)平臺(tái)測(cè)定。將在親本間具有多態(tài)性的分子標(biāo)記用于遺傳連鎖群構(gòu)建，利用Joinmap 4.1構(gòu)建遺傳連鎖群，結(jié)合白粉病多年多點(diǎn)的表型數(shù)據(jù)，使用IciMapping 4.1 檢測(cè)每種環(huán)境下與病害嚴(yán)重度、AUDPC 和平均病害嚴(yán)重度（mean final disease severity，MFDS）3 個(gè)性狀相關(guān)的QTL 位點(diǎn)，LOD 值采用1 000 次模擬算法而得，P值小于0.05 時(shí)為顯著，所獲得每個(gè)位點(diǎn)按照美國(guó)農(nóng)業(yè)部推薦的規(guī)則進(jìn)行命名。采用MapChart 軟件繪制遺傳連鎖圖。

1.6 遺傳及統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)IBM SPSS 軟件計(jì)算白粉病在不同環(huán)境中病害嚴(yán)重度值之間的Pearson 相關(guān)系數(shù)，在SAS 9.4 軟件中做ANOVA 分析來(lái)評(píng)估單個(gè)、成對(duì)或者2 對(duì)以上位點(diǎn)之間是否存在顯著的互作效應(yīng)。利用國(guó)際小麥基因組測(cè)序聯(lián)盟發(fā)表的中國(guó)春參考基因組物理圖譜信息[23]（International Wheat Genome Sequencing Consortium，2018）預(yù)測(cè)定位到每個(gè)QTL 的物理區(qū)間，并與已發(fā)表QTL 進(jìn)行初步比較，判斷本研究所定位QTL 的新穎性。

2 結(jié)果

2.1 病害嚴(yán)重度的相關(guān)性分析及FDS 的分布

通過(guò)IBM SPSS 軟件計(jì)算白粉病在不同環(huán)境中病害嚴(yán)重度值之間的Pearson 相關(guān)系數(shù)，分析顯示，該RIL 群體在2 年河南的環(huán)境下，其最終病害嚴(yán)重度的相關(guān)系數(shù)為0.67，達(dá)到極顯著水平（P＜0.0001）。此外，由于田間發(fā)病不充分或者病原菌生理小種差異，2020 年在武漢調(diào)查的群體后代FDS 與其他表型數(shù)據(jù)之間呈現(xiàn)較低的相關(guān)性（0.06—0.13）。

在苗期，小麥品種Arableu#1 對(duì)白粉病表現(xiàn)為感病，而成株期表現(xiàn)為高抗，表明Arableu#1 是一個(gè)典型的白粉病成株抗性小麥品種（圖1）。由圖2 可知，Arableu#1 在河南2 年的種植環(huán)境下最終病害嚴(yán)重度（final disease severity，F(xiàn)DS）均不超過(guò)10%，Apav#1則表現(xiàn)出高感白粉病，其最終病害嚴(yán)重度均不低于70%。含有142 個(gè)家系的Arableu#1×Apav#1 F5群體，其FDS 在2 年的環(huán)境條件下均呈連續(xù)性分布（圖2），表明Arableu#1 所含成株抗性基因?qū)儆诘湫偷臄?shù)量性狀遺傳，由多個(gè)基因所控制。

圖1 雙親Arableu#1 和Apav#1 在溫室苗期（A）和成株期（B）的條銹病反應(yīng)性及雙親在田間白粉病成株期的表型（C）Fig.1 Phenotype of powdery mildew for two parents Arableu#1 and Apav#1 in the greenhouse at seedling (A) and adult plant stage(B) and in the field in the adult plant stage (C)

圖2 Arableu#1×Apav#1 群體白粉病最終嚴(yán)重度田間分布頻率直方圖Fig.2 Frequency distributions for FDS of powdery mildew of Arableu#1×Apav#1 in field traits

2.2 成株抗性QTL 分析

通過(guò)GBS 測(cè)序獲得4 298 個(gè)在親本間具有多態(tài)性的分子標(biāo)記并進(jìn)行群體檢測(cè)[24]，所獲基因型用于構(gòu)建整個(gè)群體的遺傳連鎖圖，結(jié)合多年多點(diǎn)病害表型，使用IciMapping 4.1 對(duì)田間病害嚴(yán)重度、病程曲線下面積（AUDPC）和病害多年平均嚴(yán)重度（MFDS）等性狀QTL 進(jìn)行定位，共檢測(cè)到6 個(gè)穩(wěn)定的白粉病成株抗性QTL，分別位于1BL、2DS、4BL、5BL、6BS 和7BL（表1 和圖3），命名為QPm.hzau-1BL、QPm.hzau-2DS、QPm.hzau-4BL、QPm.hzau-5BL、QPm.hzau-6BS和QPm.hzau-7BL。在QTL 分析過(guò)程中，由于將抗病親本的遺傳效應(yīng)固定，當(dāng)其加性效應(yīng)（add 值）為負(fù)值時(shí)，表明該QTL 效應(yīng)由感病親本所提供。因此，本研究中來(lái)自抗病親本Arableu#1的QTL分別是QPm.hzau-1BL、QPm.hzau-5BL、QPm.hzau-6BS和QPm.hazu-7BL，其余2 個(gè)位點(diǎn)均來(lái)自感病親本Apav#1。

表1 Arableu#1×Apav#1 重組自交系群體抗白粉病成株抗性QTL 檢測(cè)Table 1 QTL mapping for adult plant resistance to powdery mildew in an F5 RIL population of Arableu#1×Apav#1

圖3 白粉病抗性位點(diǎn)遺傳連鎖圖譜Fig.3 Likelihood plots for adult plant resistance loci to powdery mildew

來(lái)自抗病親本Arableu#1 的QTL 中，效應(yīng)最大且穩(wěn)定存在于多個(gè)環(huán)境下的QTL 是QPm.hzau-1BL，該QTL 位于小麥基因組1BL 染色體上，可解釋白粉病表型變異的17.0%—22.9%。將該位點(diǎn)的緊密連鎖標(biāo)記序列與國(guó)際小麥基因組測(cè)序聯(lián)盟構(gòu)建的中國(guó)春參考基因組物理圖譜信息進(jìn)行比對(duì)，推測(cè)該位點(diǎn)的物理區(qū)間位于669—680 Mb。效應(yīng)次之的是位于7B 染色體末端的位點(diǎn)QPm.hzau-7BL，該位點(diǎn)在河南2019 年的環(huán)境及河南2020 年AUDPC 中均被檢測(cè)到，其物理位置為744 Mb 左右，可解釋表型變異的6.5%—19.3%。QPm.hzau-5BL可解釋表型變異的范圍為 12.3%—13.5%，QPm.hzau-6BS的抗性效應(yīng)相對(duì)較小，僅在河南2019 年環(huán)境下被檢測(cè)到，可解釋5.6%—14.6%的表型變異。來(lái)自感病親本Apav#1 的QPm.hzau-2DS提供的抗性效應(yīng)較低，可解釋表型變異的3.0%—7.7%，QPm.hzau-4BL相較于QPm.hzau-2DS更穩(wěn)定且具有更高的表型變異貢獻(xiàn)率，可解釋白粉病表型變異的10.0%—28.5%。

1.8 GO、KEGG富集分析及GSEA 利用R軟件clusterProfiler包[13]對(duì)得到的樞紐模塊中基因進(jìn)行GO富集及KEGG通路分析，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外將測(cè)試集GSE73731中265例腎透明細(xì)胞癌樣本根據(jù)樞紐基因表達(dá)值中位數(shù)分成高低表達(dá)兩組進(jìn)行GSEA[14]，選擇c2.cp.kegg.v6.0.symbols.gmt作為參考基因集，F(xiàn)DR<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 QTL 間互作效應(yīng)分析

在SAS 9.4 軟件中做ANOVA 分析來(lái)評(píng)估單個(gè)、成對(duì)或者2 對(duì)以上位點(diǎn)之間是否存在顯著的互作效應(yīng)，并將互作效應(yīng)顯著的位點(diǎn)組合進(jìn)行匯總（表2）。單位點(diǎn)結(jié)果顯示，來(lái)自感病親本Apav#1 的微效抗性位點(diǎn)QPm.hzau-2DS和QPm.hzau-4BL提供的抗性效應(yīng)相較于來(lái)自抗病親本的4 個(gè)位點(diǎn)較小。多位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，當(dāng)微效抗性位點(diǎn)與QPm.hzau-1BL聚合或至少3 個(gè)微效抗性位點(diǎn)共同作用時(shí)，可使得小麥品種（系）在田間表達(dá)高水平抗性。6 個(gè)位點(diǎn)聚合時(shí)的群體平均病害嚴(yán)重度達(dá)到各位點(diǎn)組合中的最低水平，QPm.hzau-1BL、QPm.hzau-4BL、QPm.hzau-5BL和QPm.hzau-7BL4 個(gè)位點(diǎn)聚合后的效應(yīng)僅次于6 個(gè)位點(diǎn)同時(shí)存在。此外，獲得1 個(gè)可能聚合6 個(gè)位點(diǎn)的家系（RIL-1481），其田間白粉病抗性達(dá)到近免疫水平。

表2 Arableu#1 中成株抗白粉病位點(diǎn)效應(yīng)以及多位點(diǎn)互作分析Table 2 ANOVA of mean final disease severity (MFDS) for powdery mildew (PM) resistance loci

2.4 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及QTL 分布檢測(cè)

由于QPm.hzau-5BL和QPm.hzau-7BL對(duì)白粉病抗性效應(yīng)較大，將與兩位點(diǎn)緊密連鎖的 SNP 標(biāo)記4992023|F|0-12:C＞T和3023211|F|0-16:G＞T分別轉(zhuǎn)換為KASP 標(biāo)記，并檢測(cè)了本研究的142 個(gè)RIL 家系。結(jié)果顯示，這兩個(gè)標(biāo)記分別位于5BL 和7BL 的顯著QTL 位點(diǎn)區(qū)間內(nèi)（圖4，相關(guān)序列分別為KASP-5B-1：5′-CACTGCCGTGCGCCCAAATC/CACTGCCGTGCG CCCAAATT/AACATGGGTTGCTGTCCGTT-3′；KASP-7B-2：5′-TTTGAAGCGGACTTGCAAAAG/TTTGAAG CGGACTTGCAAAAT/CCTGGCTGCCCAAGTCCA-3′）。因此，標(biāo)記KASP-5B-1和KASP-7B-2分別可作為檢測(cè)QPm.hzau-5BL和QPm.hzau-7BL的有效標(biāo)記，用于選育持久抗白粉病的小麥品種。

圖4 含有5BL 和7BL 染色體KASP 標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜Fig.4 Likelihood plots containing KASP markers for the 5BL and 7BL chromosomes

此外，利用新開(kāi)發(fā)的2 個(gè)標(biāo)記分別對(duì)570 份自然群體材料進(jìn)行單倍型分型，結(jié)果表明，QPm.hzau-5BL和QPm.hzau-7BL的分布頻率分別為42.1%和49.1%，僅含QPm.hzau-5BL材料數(shù)量為105 份，平均病害嚴(yán)重度約32.9%，而僅含QPm.hzau-7BL材料為141 份，平均病害嚴(yán)重度約15.6%。同時(shí)含有2 個(gè)位點(diǎn)材料的平均病害嚴(yán)重度相較于不含兩位點(diǎn)的材料降低了33%（圖5-B）。對(duì)自然群體中141 份CIMMYT 材料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，同時(shí)含有兩位點(diǎn)的材料約占總數(shù)的31%。對(duì)自然群體中我國(guó)小麥種質(zhì)資源進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)含有兩位點(diǎn)的材料僅占總數(shù)的11%，即采醬麥、和尚麥、紅麥、花街長(zhǎng)白蠶、紫皮、云6、新-224、合作4 號(hào)、吉春1016、北京0045、京冬22、京花2 號(hào)、中運(yùn)1 號(hào)、濟(jì)南9 號(hào)、濟(jì)麥22 號(hào)、聊麥16 號(hào)、魯麥5 號(hào)、魯麥11 號(hào)、泰農(nóng)18、煙農(nóng)19 號(hào)、新麥9 號(hào)、綿麥39、綿麥41、綿麥43、鄂麥15、鄂麥16、連麥2 號(hào)、寧麥15、皖麥31 和濰麥8 號(hào)。

圖5 QTL 在自然群體內(nèi)分布檢測(cè)及效應(yīng)分析Fig.5 QTL distributions and effect analysis in the natural materials

3 討論

CIMMYT 普通小麥品系A(chǔ)rableu#1 于2018 年在埃塞俄比亞審定，該品種在田間對(duì)白粉病表現(xiàn)良好抗性，其內(nèi)在的抗性遺傳機(jī)理尚不明確。本研究表明，Arableu#1 在苗期對(duì)白粉病表現(xiàn)出高感，而成株期在田間表現(xiàn)出高水平抗性且后代遺傳群體田間病害嚴(yán)重度呈連續(xù)性分布，故推斷該品種應(yīng)該攜帶小麥白粉病成株抗性基因且由數(shù)量性狀基因所控制，這與本研究結(jié)果中定位到的4 個(gè)抗白粉病QTL 均來(lái)自抗病親本Arableu#1 相一致。

3.1 已定位QTL 與已知位點(diǎn)對(duì)比

本研究所獲得白粉病抗性位點(diǎn)QPm.hzau-1BL在2 年中均穩(wěn)定存在，基于緊密連鎖分子標(biāo)記物理位置，初步確定其物理區(qū)間在669.2—673.7 Mb。經(jīng)驗(yàn)證該位點(diǎn)與本實(shí)驗(yàn)室前期在同一遺傳群體中定位到銹病成株抗性QTL 相一致，為已知一因多效抗性基因Lr46/Yr29/Sr58/Pm39。此外，YUAN 等[24]利用Lr46/Yr29的緊密連鎖分子標(biāo)記csLV46G22對(duì)本研究的RIL 群體進(jìn)行基因型分析，通過(guò)單標(biāo)記分析進(jìn)一步證實(shí)該群體中含有Lr46/Yr29/Sr58/Pm39。目前，該基因的克隆工作正在進(jìn)行，STS 標(biāo)記csLV46G22可有效用于小麥白粉病成株抗性分子標(biāo)記輔助育種。此外，Lr46/Yr29/Sr58/Pm39除對(duì)以上4 種病害表現(xiàn)成株抗性外，還伴隨葉尖壞死現(xiàn)象，可作為田間選擇的形態(tài)標(biāo)記。兼抗3 種銹病及白粉病的成株抗性基因的發(fā)掘及克隆，能夠極大豐富國(guó)內(nèi)外小麥兼抗多種病害的種質(zhì)資源。

QPm.hzau-5BL與該位點(diǎn)的緊密連鎖標(biāo)記的連鎖距離變化為0.5—1.5 cM，其物理位置介于564.1—571.3 Mb。目前，在5B 染色體上命名的主效基因有Pm36和Pm53，分別來(lái)源于野生二粒小麥和擬斯卑爾脫山羊草[25-26]。BOUGOT 等[27]在小麥品種Courtot的 5BL 染色體上檢測(cè)到白粉病成株抗性位點(diǎn)QPm.inra-5B.2，該位點(diǎn)可解釋表型變異的11.1%，gwm604和gwm790b為其緊密連鎖標(biāo)記；KELLER 等[28]在Forno×Oberkulmer 群體中，定位到一個(gè)白粉成株抗性位點(diǎn)QPm.sfr-5B，可提供12.6%的抗性效應(yīng)，Xpsr580b和Xpsr143為該位點(diǎn)的緊密連鎖標(biāo)記；ASAD等[29]在Strampelli×輝縣紅群體中的5BL 染色體上定位到2 個(gè)與白粉病成株抗性相關(guān)的位點(diǎn)，其物理區(qū)間分別位于418.8—454.7 Mb 和454.7—507.7 Mb。基于緊密連鎖分子標(biāo)記物理位置，本研究結(jié)果中所發(fā)掘的QPm.hzau-5BL與已報(bào)道白粉病成株抗性QTL 應(yīng)該不是同一位點(diǎn)。

本研究所發(fā)掘的QPm.hzau-6BS可解釋5.6%—14.6%的表型變異，與分子標(biāo)記3027047|F|0-12:T＞C緊密連鎖，位于物理區(qū)間249.5—346.8 Mb。LAN等[30]在百農(nóng)64×京雙16 群體的6BS 染色體上檢測(cè)到一個(gè)白粉病成株抗性QTL，其與SSR 標(biāo)記Xbarc79和Xgwm518緊密連鎖，其物理位置約為88.9 Mb。LILLEMO 等[31]在Folke×T2038 群體的6BS 染色體上同樣檢測(cè)到一個(gè)白粉成株抗性QTL，其物理位置在67.9 Mb 附近，與分子標(biāo)記wPt-6437和wmc494緊密連鎖，經(jīng)過(guò)與本研究定位到的QTL 物理位置比較，發(fā)現(xiàn)二者與QPm.hzau-6BS均不同。目前，在 6B 染色體上已命名抗白粉病基因有Pm11、Pm12、Pm14、Pm20、Pm27和Pm5，其中Pm12、Pm20和Pm27分別來(lái)源于擬斯卑爾脫小麥、黑麥和提莫非維小麥的易位系，且為苗期抗性基因，Pm11和Pm14僅對(duì)一些雜草白粉病表達(dá)抗性，Pm54則位于6B 染色體長(zhǎng)臂上[32-37]。綜上所述，QPm.hzau-6BS應(yīng)該是一個(gè)來(lái)自普通小麥新的白粉病成株抗性位點(diǎn)。

QPm.hzau-7BL與分子標(biāo)記3023211|F|0-16:G＞T和1048655緊密連鎖且位于739.5—750.1 Mb 區(qū)間內(nèi)。位于該染色體臂有已知抗白粉病基因Pm5d[38]，其緊密連鎖標(biāo)記為gwm611和gwm577，與國(guó)際小麥基因組測(cè)序聯(lián)合會(huì)構(gòu)建的中國(guó)春參考基因組物理圖譜信息進(jìn)行比對(duì)，推測(cè)該位點(diǎn)物理區(qū)間為700.6—711.2 Mb。LILLEMO 等[39]在Saar×Avocet 群體的7BL 染色體上檢測(cè)到一個(gè)白粉成株抗性位點(diǎn)QPm.nuls-7BL，其物理區(qū)間在 712.6—718.4 Mb，介于分子標(biāo)記wmc581和wPt-8007之間；CHANTRET 等[40]在RE714的 7BL 染色體上檢測(cè)到一個(gè)白粉成株抗性位點(diǎn)QPm.inra-7B，其緊密連鎖標(biāo)記為gwm577和Xpdac01，經(jīng)比對(duì)其物理位置位于711 Mb 附近。以上位點(diǎn)可能是同一QTL，也可能是緊密連鎖的不同QTL，需進(jìn)一步分析驗(yàn)證。

3.2 已定位QTL 在育種中的應(yīng)用

雖然含單個(gè)抗病基因的優(yōu)良小麥品種在抗病育種中已發(fā)揮重要作用，但由于白粉病菌種群數(shù)量大、異質(zhì)性高，攜帶單一抗病基因的品種抗性容易喪失，多個(gè)抗病基因的聚合可以有效緩解病原菌的變異壓力，特別對(duì)于微效成株抗性基因進(jìn)行聚合尤為重要。前人研究表明，4—5 個(gè)微效抗病基因聚合在同一小麥品種中，可致使其抗性接近免疫水平[41]。本研究結(jié)果同樣表明當(dāng)多個(gè)微效抗性QTL 在與成株抗性基因Lr46/Yr29/Sr58/Pm39聚合時(shí)，可使得小麥品種（系）在田間表現(xiàn)高水平白粉病抗性，其中，包含來(lái)自感病親本 Apav#1 的微效抗性位點(diǎn)QPm.hzau-2DS和QPm.hzau-4BL。QPm.hzau-1BL、QPm.hzau-4BL、QPm.hzau-5BL和QPm.hzau-7BL4 個(gè)位點(diǎn)的聚合可有效應(yīng)用于抗病育種。選用含有以上4 個(gè)位點(diǎn)且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的家系，與我國(guó)不同麥區(qū)小麥主推但感白粉病品種（系）雜交，后期采用 DH 技術(shù)純合，利用所開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記輔助選擇，可以極大程度縮短育種年限，培育出適合我國(guó)不同麥區(qū)種植的農(nóng)藝性狀優(yōu)良且抗白粉病的小麥新種質(zhì)。

本研究通過(guò)開(kāi)發(fā)QPm.hzau-5BL和QPm.hzau-7BL的新分子標(biāo)記并對(duì)570 份自然群體進(jìn)行基因型檢測(cè)，結(jié)果顯示，僅含QPm.hzau-5BL或QPm.hzau-7BL材料平均病害嚴(yán)重度均顯著低于不含2 個(gè)抗性位點(diǎn)材料，同時(shí)聚合2 個(gè)抗性位點(diǎn)的材料其田間白粉病嚴(yán)重度顯著低于僅含有QPm.hzau-5BL的材料，但相較于僅含有QPm.hzau-7BL時(shí)未顯著降低。該結(jié)果可能是由于自然群體中部分材料含有其他未知抗病基因，進(jìn)而掩蓋了5BL 和7BL 的互作抗性效應(yīng)。此外，檢測(cè)結(jié)果表明，這兩個(gè)位點(diǎn)在CIMMYT 材料中分布頻率較高，而在我國(guó)小麥材料則較少，提倡我國(guó)小麥抗病育種家可對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)的聚合進(jìn)行廣泛應(yīng)用。

4 結(jié)論

Arableu#1 是一個(gè)典型的白粉病成株抗性小麥品種，結(jié)合群體基因型與表型進(jìn)行QTL 分析，共檢測(cè)到6 個(gè)白粉病成株抗性QTL，分別位于1BL、2DS、4BL、5BL、6BS 和7BL 上，其中QPm.hzau-1BL、QPm.hzau-5BL、QPm.hzau-6BS、QPm.hzau-7BL均來(lái)源于抗病親本Arableu#1。QPm.hzau-1BL為一因多效抗病基因Lr46/Yr29/Sr58/Pm39，QPm.hzau-5BL、QPm.hzau-6BS、QPm.hzau-7BL可能是新的白粉病抗性位點(diǎn)，其中，QPm.hzau-5BL和QPm.hzau-7BL在田間白粉病抗性效應(yīng)較大。當(dāng)微效抗性QTL 在與成株抗性基因Lr46/Yr29/Sr58/Pm39共同作用時(shí)，可使得小麥品種（系）在田間表達(dá)高水平抗性。

將QPm.hzau-5BL和QPm.hzau-7BL的兩翼分子標(biāo)記分別成功開(kāi)發(fā)成KASP 標(biāo)記，經(jīng)對(duì)570 份世界各地育成品種或地方品種檢測(cè)，2 個(gè)位點(diǎn)單獨(dú)存在及聚合在一起時(shí)對(duì)白粉病均表現(xiàn)出不同程度的抗病性，且這兩個(gè)位點(diǎn)在CIMMYT 的小麥種質(zhì)中分布較為廣泛，而在我國(guó)小麥材料中分布頻率較低。

成功開(kāi)發(fā)了與抗性QTL 緊密連鎖的KASP 標(biāo)記。此外，獲得1 個(gè)可能聚合6 個(gè)位點(diǎn)的家系，其田間白粉病抗性達(dá)到近免疫水平。