飲用水中銅綠假單胞菌快速檢測的研究進展

丁言炎 章小洪 鄭連寶 沈敏炬

基金項目：浙江省市場監督管理局科研計劃資助項目（ZC2021B077）。

作者簡介：丁言炎（1972—），男，浙江湖州人，本科，工程師。研究方向：食品安全檢驗檢測。

通信作者：沈敏炬（1981—），男，浙江湖州人，本科，主管藥師。研究方向：食品安全檢驗檢測。E-mail： shenminju@163.com。

摘 要：銅綠假單胞菌是一種條件致病菌，廣泛存在于各類水體環境中，對消毒劑、紫外線等因素具有很強的抵抗力，可引起急性腸道炎等各種疾病。本文主要闡述了5種飲用水中銅綠假單胞菌快速檢測技術的優點和具體應用，可為飲用水中銅綠假單胞菌的檢驗檢測和質量控制工作提供參考。

關鍵詞：銅綠假單胞菌；快速檢測；飲用水

Research Progress of Rapid Detection of Pseudomonas aeruginosa in Drinking Water

DING Yanyan1， ZHANG Xiaohong2， ZHENG Lianbao1， SHEN Minju1*

（1.Deqing Food and Drug Inspection and Testing Center， Huzhou 313200， China; 2.Lishui Institute for Quality Inspection and Testing， Lishui 323000， China）

Abstract： Pseudomonas aeruginosa is a opportunistic pathogen that widely exists in various water environments. It has strong resistance to disinfectants， ultraviolet rays， and other factors， and can cause various diseases such as acute enteritis. This paper mainly expounds the advantages and specific applications of rapid detection technology of Pseudomonas aeruginosa in five kinds of drinking water， which can provide reference for the detection and quality control of Pseudomonas aeruginosa in drinking water.

Keywords： Pseudomonas aeruginosa; rapid detection; drinking water

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）又稱綠膿桿菌，是一種常見的水源性致病菌，廣泛存在于各類水體中，對消毒劑、紫外線等理化因素具有很強的抵抗力，可引起敗血癥、腦膜炎和急性腸道炎等疾病。世界衛生組織的食品安全評估明確指出，銅綠假單胞菌是嬰兒瓶裝飲用水的危害指示菌[1]。

隨著全球飲用水消費量的不斷增加，有關飲用水中銅綠假單胞菌污染的報道屢見不鮮，飲用水食品安全問題日益引起了人們的關注[2-7]。世界衛生組織明確指出，與飲用水有關的安全問題大多來自微生物污染[8]。2019年初，《消費者報道》整理了2014—2018年國家及省級市場監督管理局關于桶裝水的質量抽檢情況，共檢出2 350批次不合格的桶裝水，其中銅綠假單胞菌檢出高達1 551次，占比66%。顯然，銅綠假單胞菌污染是影響桶裝飲用水質量安全的最主要問題，也是長期困擾生產企業質量控制技術的難題[9-11]。

2015年，《食品安全國家標準 包裝飲用水》

（GB 19298—2014）將銅綠假單胞菌作為各類包裝飲用水質量檢測指標之一?！妒称钒踩珖覙藴?飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2022）是國內飲用水中銅綠假單胞菌項目檢測的“金標準”，但該方法檢測實驗次數多、操作復雜、耗時長，難以快速檢測樣品。因此，國內外研究者們正致力于研究和開發一種簡單、快速、準確的銅綠假單胞菌檢測技術。近年來，隨著信息生物學、分子生物學技術的快速發展，聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）、定量PCR、多重PCR及環介導等溫擴增技術等憑借簡便省時、特異性強、靈敏度高等優點，被廣泛應用于飲用水中銅綠假單胞菌的檢驗檢測和研究。

1 銅綠假單胞菌的快速檢測技術

1.1 基于多重熒光定量PCR技術快速檢測

熒光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）方法，基于常規PCR和熒光標記技術的先進分子生物學手段，具有用時短、靈敏度高、特異性強等優點[12]，已被廣泛應用于食源性致病菌的檢測。龍慧等[13]以uidA和gyrB基因作為引物和探針，建立能同時檢測銅綠假單胞菌和大腸埃希氏菌的多重熒光定量PCR體系，該法檢測時間短，可在2 h內完成PCR擴

增；靈敏度高，兩菌的檢測限均為102 CFU·mL-1；特異性強，能準確識別各類非目標菌，且引物與探針間無交叉擴增；銅綠假單胞菌加標回收率大于70%。在一定程度上彌補了飲用水中銅綠假單胞菌和大腸埃希氏菌傳統檢測方法的缺陷，加快了飲用水食品質量安全建設。

1.2 實時熒光環介導等溫擴增檢測

聚合酶鏈式反應可利用引物，在酶的作用下，短時間內完成核酸信號擴大。相比常規的PCR技術，新型熒光定量PCR技術則通過帶熒光的探針，實現實時熒光定量檢測。實時熒光環介導等溫擴增檢測是一種實時熒光與環介導等溫擴增相結合的檢測方法。曾思思等[14]利用銅綠假單胞菌的外毒素A基因（Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A，PEA）序列，設計LAMP引物，開發出一款快速、靈敏、操作簡便的實時熒光環介導等溫擴增檢測銅綠假單胞菌的方法，該方法特異性強，且與其他菌株不存在交叉反應，檢出限可達5.2 CFU·mL-1。

1.3 基于聚合酶螺旋反應的銅綠假單胞菌檢測技術

聚合酶螺旋反應（Polymerase Spiral Reaction，PSR）是一種利用混合引物，以Bst DNA聚合酶的鏈置換活性及其擴增為體系，通過引物結合—延伸—解鏈—單鏈旋轉及再次延伸的循環，在等溫條件下，實現擴增核酸的恒溫擴增技術。PSR法兼具LAMP法和PCR法的優點，如引物設計簡單、只需一種酶、反應高效等。與PCR法相比，該方法能在恒溫條件下完成核酸擴增反應，無須電泳步驟，敏感性高，可實時檢測。朱淵等[15]利用銅綠假單胞菌外毒素A調控基因-ETA基因（toxA）設計引物，通過加入加速引物、選擇合適顏色指示劑和優化反應條件，建立PSR快速檢測銅綠假單胞菌的方法?？梢暬腜SR方法為銅綠假單胞菌快檢提供了一種可行有效的新技術，該方法在65 ℃等溫條件下，在40 min內可完成PSR反應步驟，且能利用鈣黃綠素和羥基萘酚藍反應產生的色差直接判讀結果。與傳統檢測方法相比，PSR方法靈敏度高，可視化效果好，且最低檢出限為20 CFU·mL-1。

1.4 基于重組酶介導等溫擴增法檢測銅綠假單胞菌

重組酶介導等溫擴增（Recombinase-Aided Amplification，RAA）是一種利用3種酶（重組酶、單鏈結合蛋白、DNA聚合酶）在等溫件下進行核酸擴增的技術。與傳統PCR方法及其他等溫擴增技術相比，其優勢是檢測速度快、操作簡便，且設備體積小，便于攜帶，適用于現場快速檢測和基層實驗室。

姚麗鋒等[16]通過對銅綠假單胞菌lasB基因的特異性保守區域進行分析，設計特異性引物和探針，優化組合，構建銅綠假單胞菌實時熒光RAA檢測方法，該方法特異性強（只對銅綠假單胞菌有擴增曲線，對其他細菌無交叉反應）、靈敏度高（純菌檢測靈敏度為1.7 pg·μL-1）、反應時間短（僅需20 min），適合于食品中銅綠假單胞菌的快速檢測。

1.5 環介導等溫擴增技術檢測銅綠假單胞菌

環介導等溫擴增技術（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一種基于核酸擴增的技術，相對于傳統PCR，該技術反應快、靈敏性高、特異性強。其原理為當反應溫度為60～65 ℃時，DNA雙鏈解開，在Bst DNA聚合酶的作用下，不斷地重復循環，整個過程包括循環模板合成、擴增循環、伸長再循環3個階段。DNA擴增過程中會產生大量的焦磷酸根離子，與體系中的鎂離子結合產生焦磷酸鎂沉淀，可通過顏色差異觀察結果。

曹科峰等[17]利用銅綠假單胞菌gbca基因，通過設計3對特殊的LAMP引物，同時在體系中加入熒光染料-羥基萘酚藍，通過反應色差觀察結果，并以電泳加以驗證，建立了一種簡單、快速的基于色差變化判定結果的LAMP檢測銅綠假單胞菌的方法，其靈敏性優于PCR法檢測。該方法在包裝水、食品、化妝品等領域均有較好的運用[18-20]。

2 結語

在食品檢驗領域，簡單、即時、快速和準確地完成檢驗檢測，是研究學者追求的目標。本文主要綜述了5種飲用水中銅綠假單胞菌的快速檢測方法。隨著新技術、新儀器不斷涌現，各種檢驗技術也不斷更新，且相關學者在不斷探索創新其他技術和方法，以期銅綠假單胞菌的檢驗不再受時間、地點、操作等條件的限制，實現快速、高效、準確檢測，保障人們飲用水質量安全。

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