高效液相色譜法測定鹵牛肉中苯甲酸含量的不確定度評估

王珊珊 趙雯瑋 王文巧

基金項目：西藏自治區科技廳計劃項目（XZ202001ZY0058G）；西藏自治區食品藥品檢驗研究院科研項目（XZSYJY-YJKYXM-2020-02）。

作者簡介：王珊珊（1990—），女，河南安陽人，碩士，助理工程師。研究方向：食品營養、食品理化檢測。

通信作者：趙雯瑋（1978—），女，河南安陽人，碩士，高級工程師。研究方向：食品安全檢驗與食品營養成分分析。E-mail：24491675@qq.com。

摘 要：本實驗采用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測定鹵牛肉中苯甲酸的含量，并進行不確定度評估，結合數學模型與實驗全過程，確認苯甲酸標準系列溶液配制、樣品處理、標準曲線擬合、儀器測定4個過程為不確定度的主要來源，通過分析、計算，得到苯甲酸的含量為

0.215 4 g·kg-1，其擴展不確定度為0.018 5 g·kg-1，苯甲酸含量可以表示為（0.215 4±0.018 5）g·kg-1（k=2，置信區間95%）。此外，對上述4個過程的不確定度進行比較，發現標準曲線擬合過程引入的不確定度是總不確定度的主要來源，系列標準曲線配制過程和儀器測定對不確定度的影響相當，樣品制備過程的影響較小。本實驗為此類食品苯甲酸含量測定的不確定度評估提供依據。

關鍵詞：高效液相色譜法；鹵牛肉；苯甲酸；不確定度

Evaluation of Uncertainty in Determination of Benzoic Acid in Braised Beef by HPLC

WANG Shanshan， ZHAO Wenwei*， WANG Wenqiao

（Tibet Autonomous Region Food and Drug Inspection Research Institute， Lhasa 850000， China）

Abstract： This experiment used high performance liquid chromatography （HPLC） to determine the content of benzoic acid in braised beef， and evaluated the uncertainty. Combining mathematical models and the entire experimental process， it was confirmed that the preparation of benzoic acid standard series solution， sample processing， standard curve fitting， and instrument measurement were the main sources of uncertainty. Through analysis and calculation， the content of benzoic acid was 0.215 4 g·kg-1， Its expanded uncertainty is 0.018 5 g·kg-1，

and the benzoic acid content can be expressed as （0.215 4±0.018 5） g·kg-1 （k=2， confidence interval 95%）. In addition， comparing the uncertainty of the four processes mentioned above， it was found that the uncertainty introduced by the standard curve fitting process is the main source of total uncertainty. The influence of the series standard curve preparation process and the instrument measurement process? on uncertainty is similar， while the influence of the sample preparation process is relatively small. This experiment provides a basis for evaluating the uncertainty of the determination of benzoic acid content in such foods.

Keywords： high performance liquid chromatography; spiced beef; benzoic acid; uncertainty

苯甲酸作為最常見的防腐劑，能夠抑制霉菌、酵母和細菌，起到延長食品保質期的作用。然而，部分商家在肉類鹵制過程中會過量添加此類食品添加劑，對人體造成不良影響。研究表明，過量食用苯甲酸會影響攝入者腸胃消化酶的正常分泌[1-2]，降低小腸的吸收能力，使食欲減退，另外食用苯甲酸有致癌和遺傳傷害可能性[3]。

測量不確定度是根據檢驗信息，表征賦予被測量值分散性的非負參數[4]，本文對HPLC法測定鹵牛肉中苯甲酸含量的方法進行系統分析，識別測定過程中的不確定來源，建立數學模型，計算測定結果的合成標準不確定度和相對標準不確定度，為同類項目測定結果的不確定度評價和分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

鹵牛肉，市場隨機購買的陽性樣本。

苯甲酸標準物質儲備液：GBW（E）100006 22001，中國計量科學研究院；亞鐵氰化鉀：分析純，成都市科龍化工試劑廠；乙酸鋅：分析純，成都市科隆化學品有限公司；乙酸銨：色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；甲醇：色譜純，賽默飛世爾科技有限公司。

Agilen-1260 液相色譜儀，美國安捷倫公司；XP203S電子分析天平，瑞士梅特勒公司；P300H超聲波清洗儀，德國Elma；ST1L臺式高速離心機，英國賽默世爾；DMT-2500多管渦旋混合儀，中國江蘇盛藍。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

按照《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》（GB 5009.28—2016）[5]第一法液相色譜法規定過程，處理樣品。

樣品加標：取2 g（精確到0.001 g）樣品于離心管中，加入濃度為1 mg·mL-1的苯甲酸儲備溶液

0.4 mL，苯甲酸加標量為0.4 mg，同樣品處理方法處理后，過膜待上機測定。

1.2.2 苯甲酸系列標準溶液的配制

40 μg·mL-1苯甲酸中間液的配制：吸取

1.00 mg·mL-1苯甲酸儲備液1.00 mL于25 mL容量瓶中，用水定容。

苯甲酸系列標準溶液的配制：分別準確吸取

40 μg·mL-1苯甲酸中間液0.125 mL、0.500 mL、

1.000 mL、2.000 mL、3.000 mL、4.000 mL和

5.000 mL于10 mL容量瓶中，用水定容。配制成質量濃度為0.500 μg·mL-1、2.000 μg·mL-1、4.000 μg·mL-1、8.000 μg·mL-1、12.000 μg·mL-1、16.000 μg·mL-1和20.000 μg·mL-1的標準系列工作溶液。

1.2.3 液相色譜條件

流動相：甲醇∶乙酸銨（0.02 mol·L-1）=5∶95（V∶V）等度洗脫；色譜柱：Eclipse Plus C18

（250 mm×4.6 mm，5 μm）；進樣量10 μL；流速：

1.00 mL·min-1；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃。

2 不確定度評定

2.1 建立數學模型

苯甲酸含量計算公式為

（1）

式中：X為試樣中苯甲酸的含量，g·kg-1；C為標準曲線得出的試樣中苯甲酸的含量，μg·mL-1；

V為試樣定容體積，mL；m為試樣質量；g；1 000為換算因子。

2.2 不確定度主要來源分析

從樣品處理測定總流程和數學模型考慮，鹵牛肉中苯甲酸的不確定度主要來源如圖1所示。

2.3 不確定度的計算

2.3.1 苯甲酸系列標準溶液配制過程引入的相對標準不確定度urel（S）

（1）苯甲酸標準物質引入的相對標準不確定度。證書顯示：苯甲酸溶液標準物質標準值1.00 mg·mL-1；相對擴展不確定度為2%（k=2），則使用苯甲酸標準溶液引入的相對標準不確定度為urel（C）=2%÷2=0.01。

（2）40.00 ?g·mL-1苯甲酸中間液的配制引入的相對標準不確定度。苯甲酸中間液的配制使用了

1.00 mL移液管和25 mL容量瓶，因使用量器引入的不確定度計算過程相同，本文以1.00 mL移液管的不確定度計算為例，其他量器的不確定度計算不再贅述，并將結果匯總如表1。

1.00 mL移液管引入的不確定度計算：經查閱移液管校準證書，其準確度等級均為A級，容量允許差為±0.01 mL[6]，按照均勻分布，取，使用1.00 mL移液管引入的標準不確定度為。

設移取液體時的溫度與校準要求溫度的差異為±5 ℃，水的膨脹系數為2.1×10-4 ℃-1，因溫度差異引入的體積變化為±（1.00×5×2.1×10-4）=±0.001 05 mL，

按均勻分布，，吸取液體時溫度差異引入的標準不確定度為。

綜上，使用一次1.00 mL移液管引入的標準不確定度為

使用一次1.00 mL移液管引入的相對標準不確定度為。

由表1可知使用一次25 mL容量瓶引入的標準不確定度和相對標準不確定度分別為u（V25）=

0.023 0 mL、urel（V25）=0.000 92。

苯甲酸中間液配制過程引入的相對標準不確定度為

苯甲酸系列濃度標準溶液配制過程中引入的不確定度。苯甲酸系列濃度標準溶液配制過程分別用到了1.00 mL移液管3次、5.00 mL移液管4次和

10 mL容量瓶7次。該過程引入的標準不確

定度為

苯甲酸標準物質配制過程引入的相對標準不確定度為

2.3.2 苯甲酸標準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel（X）

苯甲酸標準系列濃度溶液經安捷倫高效液相色譜儀收集并積分，得到各濃度點x與其相對應的峰面積y，濃度和峰面積擬合的線性回歸方程為y=ax+b（a為斜率，b為截距），測定結果如表2所示。

根據貝塞爾公式[7]，得到苯甲酸標準曲線的剩余標準偏差為

（2）

本次實驗對兩套標準溶液進行了測定，苯甲酸標準溶液平均濃度為C標=8.93 μg·mL-1。苯甲酸標準曲線的不確定度為

（3）

式（2）和式（3）中：a=21.965，b=-6.269 2，p=14（對標品進行14次測量）；n=14（7個濃度的標準樣品分別測定2次）。。則

苯甲酸標準曲線擬合引入的相對標準不確定度為。

2.3.3 樣品處理過程引入的相對標準不確定度urel（M）

（1）稱量過程引入的不確定度。經查閱檢定證書，樣品的稱量質量為2.0 g，在0.01 g≤m≤50.00 g范圍內時，天平最大允許誤差為±0.000 5 g，天平引入的不確定度呈均勻分布，天平的標準不確定度和相對標準不確定度計算為

（2）樣品定容過程引入的不確定度。在樣品處理過程中用到了50 mL容量瓶，根據表1可知其標準不確定度和相對標準不確定度分別為u（V50）=

0.041 9 mL、urel（V50）=0.000 838。

（3）樣品處理過程引入的不確定度。在處理的過程中，添加亞鐵氰化鉀和乙酸鋅除蛋白以及定容轉移過程使得樣品中苯甲酸不能全部收至待測液中，苯甲酸的回收率在91.31%～99.71%（表3），回收率的標準偏差為2.452%，處理過程引入的標準不確定度與相對標準不確定度

分別為

（4）樣品處理全過程中引入的合成相對標準不確定度為

2.3.4 儀器測定過程引入的相對標準不確定度urel（Ap）

高效液相色譜儀自身的不確定度和峰面積的重復性測定引入的不確定度構成了儀器測定引入的標準不確定度。

（1）高效液相色譜儀自身的不確定度。查閱儀器的檢定證書，其不確定度為3%，k=2，故儀器自身引入的相對標準不確定度為

（2）重復測定引入的相對標準不確定度。各樣品的峰面積結果見表2，重復測定（n=10）引入的標準不確定度和相對標準不確定度分別為

（3）儀器測定引入的相對標準不確定度為

2.3.5 合成標準不確定度u（H）與擴展不確定度U

高效液相色譜法測定鹵牛肉中苯甲酸含量的合成相對標準不確定度計算為

本次實驗測得鹵牛肉中苯甲酸的平均含量

X=0.215 4g·kg-1，其合成標準不確定度為

u（H）=X×urel（H）=0.215 4×0.043 0=0.009 262 g·kg-1

當置信區間為95%時，包含因子為k=2，得到擴展不確定度U=k×u（H）=2×0.009 262=0.018 5 g·kg-1

高效液相色譜法測定鹵牛肉中苯甲酸的含量結果表示為X=（0.215 4±0.018 5）g·kg-1（k=2，置信區間95%）。

3 結論

本次實驗表明多次稱量并測定可以有效避免取樣不均的問題，樣品的處理過程對總不確定度的影響較小。主要不確定度來源為標準曲線的擬合，標準苯甲酸系列溶液的配制和儀器的測定對總不確定度的影響相當。在今后的實驗中，選擇純度更高、不確定度更小的苯甲酸標準物質，規范系列標準溶液的配制操作，選擇精密度較高、穩定性較好的測量儀器可以有效提高測定結果的準確度。

參考文獻

[1]周楠，丁紅梅，楊俊.高效液相色譜法測定藍莓酵素酒中山梨酸和糖精鈉含量的不確定度評定[J].糧食科技與經濟，2020，45（8）：95-99.

[2]官詠儀，邱志超，宋陽，等.高效液相色譜法測定葡萄酒中山梨酸含量的不確定度評定[J].食品科學，2015，36（16）：231-235.

[3]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.食品安全國家標準 食品添加劑使用標準：GB 2760—2014[S].北京：中國標準出版社，2014.

[4]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.化學分析測量不確定度評定：JJF 1135—2005[S].北京：中國計量出版社，2005.

[5]國家衛生和計劃生育委員會，國家食品藥品監督管理總局.食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和苯甲酸的測定：GB 5009.28—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

[6]國家質量監督檢驗檢疫總局.常用玻璃量器檢定規程：JJG 196—2006[S].北京：中國計量出版社，2006.

[7]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.測量不確定度評定和表示：

GB/T 27418—2017[S].北京：中國標準出版社，2017.