富GABA黃色糙米酵素發酵工藝研究

陳美琪 律振青 馬紹益 張贏月 張妍妍 王俊玲

基金項目：吉林省大學生科技創新創業訓練計劃（2022053）；吉林省科技廳吉林省科技發展計劃項目（YDZJ202101ZYTS118）。

作者簡介：陳美琪（2001—），女，吉林松原人，本科。研究方向：發酵工程。

通信作者：王俊玲（1982—），女，吉林吉林人，博士，副教授。研究方向：分子酶學工程與發酵工程。E-mail：wangjunling0432@163.com。

摘 要：目的：優化糙米發酵工藝，以提高γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid，GABA）等營養物質含量。方法：以黃色糙米為原料，添加酵母菌，經發酵產黃色糙米酵素。以GABA含量為指標，通過單因素試驗和正交試驗優化發酵條件。結果：黃糙米的最佳發酵條件為接種量2%、培養時間40 h、培養溫度32 ℃，該條件下GABA含量為0.456 mg·mL-1。結論：優化后的發酵條件后可為糙米酵素的生產應用提供依據。

關鍵詞：黃色糙米；酵母菌；γ-氨基丁酸；發酵條件

Study on Fermentation Technology of GABA-Rich Yellow Brown Rice Enzymes

CHEN Meiqi， LYU Zhenqing， MA Shaoyi， ZHANG Yingyue， ZHANG Yanyan， WANG Junling*

（College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering， Jilin Agricultural Science and Technology University， Jilin 132101， China）

Abstract： Objective： To optimize the fermentation process of brown rice in order to improve increase the content of nutrients such as γ-aminobutyric acid （GABA）. Method： Yellow brown rice is used as raw material， yeast is added， and yellow brown rice enzyme is produced through fermentation. Using GABA content as an indicator， optimize fermentation conditions through single factor and orthogonal experiments. Result： The optimal fermentation conditions for yellow brown rice were 2% inoculation amount， 40 h cultivation time， and 32 ℃ cultivation temperature. Under these conditions， the GABA content was 0.456 mg·mL-1. Conclusion： The optimized fermentation conditions can provide a basis for the production and application of brown rice enzymes.

Keywords： yellow brown rice; yeast; γ-aminobutyric acid; fermentation conditions

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid，GABA）是糙米酵素中一種重要的營養物質，具有一定的生理活性，是糙米酵素中一種非蛋白組分[1-2]。目前，GABA已被證實具有降血壓、抗癲癇、止痛、提高記憶力等藥理學功效[3-6]。酵母菌是一種重要的微生物菌種，在工業及生物工程中發揮著重要的作用。有學者研究東北酸菜發酵酵母菌凍干保護劑時發現，酵母菌輔助東北酸菜進行發酵有重大的開發前景和應用意義，加入酵母菌可大大提升發酵產品的品質及安全性，使生產過程更為可控[7]。糙米酵素是將從酸菜中選育得到的酵母菌接種至糙米培養基中經發酵產生的具有一定生物活性的物質，含有人體所需的必需元素，能夠促進機體吸收營養物質，提高免疫力[7]，還能促進新陳代謝[8]。

本文選擇具有較高富集GABA能力的酵母菌，將其添加到黃色糙米培養基中進行發酵，采用單因素試驗和正交試驗進行發酵工藝優化，以得到具有較高營養價值的黃色糙米酵素，為今后利用高產GABA酵母提升糙米酵素營養價值提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃色糙米：購自陜西漢中洋縣；酵母菌：本實驗室保存；酵母提取粉、蛋白胨、瓊脂、葡萄糖、蔗糖、碳酸鈉、四硼酸鈉以及苯酚，分析純；GABA標準品，色譜純，樂美天醫藥科技有限公司。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9243BL-Ⅲ上海新苗醫療器械制造有限公司）；高速多功能粉碎機（HC-100T常州市金壇友聯儀器研究所）；高壓蒸汽滅菌鍋（MLS-3751L-PC松下健康醫療器械株式會社）；超聲波細胞破碎機（JT202N寧波新芝生物科技股份有限公司）；恒溫振蕩培養箱（HZQ-X100A杭州奧盛儀器有限公司）；紫外可見分光光度計（UV756CRT上海佑科儀器儀表有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

將黃色糙米置于烘箱中烘干（30 ℃，40 min），用粉碎機粉碎后過60目篩，于4 ℃冰箱保存備用。稱取3 g黃色糙米粉，與YEPD培養基混合，定容至50 mL，滅菌后接種菌種進行發酵，獲得黃色糙米酵素。

采用超聲法提取GABA，超聲時間為15 min、超聲功率為350 W，然后于12 000 r·min-1下離心

5 min，上清液即為待測樣品[9]。

1.3.2 單因素試驗

（1）接種量對GABA的影響。依據前期試驗，將酵母菌以1%、2%、3%和4%的接種量接種至發酵培養基中，于32 ℃發酵培養44 h待其發酵后測定待測樣品吸光值，計算GABA含量。

（2）發酵溫度對GABA的影響。將3%酵母菌接種于發酵培養基中培養，并于30 ℃、32 ℃、34 ℃和36 ℃下發酵培養44 h，測定待測樣品吸光值，計算GABA含量。

（3）發酵時間對GABA含量的影響。將3%酵母菌接種于發酵培養基中培養，于32 ℃分別培養32 h、36 h、40 h和44 h，測定待測樣品吸光值，測定GABA含量。

1.3.3 正交試驗

根據單因素試驗結果，以接種量、發酵溫度、發酵時間為考察因素，進行L9（33）正交試驗。因素水平設計如表1所示。

1.3.4 糙米酵素GABA含量測定

GABA含量測定方法依據GABA中游離氨與苯酚及次氯酸鈉產生一系列作用，最終導致樣品產生藍綠色反應進行。用Berthelot比色法測定待測樣品吸光值，通過標準曲線計算GABA含量[10-11]。

準確稱量10 mg GABA標準品，加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液溶解，用純化水定容至10 mL，分別配制成濃度為0 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、

0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1和1.0 mg·mL-1的標準品溶

液。參考文獻[10]，以GABA濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制GABA標準曲線。

2 結果與分析

2.1 GABA標準曲線繪制

以GABA濃度為橫坐標，OD640值為縱坐標，繪制GABA標準曲線（圖1），得到線性方程為y=0.868x+0.017 3，相關系數R?=0.996 4。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 接種量對黃糙米GABA含量影響

由圖2可知，當培養基接入3%酵母菌時，GABA含量最大；當接入酵母菌的量高于3%時，GABA含量呈下降趨勢。綜合考慮，本研究選擇2%、3%、4% 3個水平進行進一步研究。

2.2.2 發酵溫度對黃糙米GABA含量影響

從圖3可以看出，當發酵溫度達到32 ℃時，GABA含量最大；繼續升高發酵溫度，GABA含量逐漸減小。這可能是因為隨著溫度的提高，酵母的增殖和代謝受到了抑制，酵母中的蛋白酶活性減弱，GABA的產量也隨之減少。綜合考慮，正交試驗中選取30 ℃、32 ℃、34 ℃進行下一步試驗。

2.2.3 發酵時間對黃糙米GABA含量影響

從圖4可得，GABA含量在發酵時間為40 h時達到最大，繼續延長發酵時間，酵母菌的活力降低，GABA的產量也隨之降低。綜合考慮，選取36 h、40 h、44 h進行下一步試驗。

2.3 正交試驗結果

由表2可知，黃糙米的發酵時間對GABA含量的影響最大，其次為酵母菌接種量，發酵溫度影響最小。分析可知，黃糙米的最優發酵條件為A1B2C2，與試驗設計中最佳組合一致，即酵母菌接種量為2%，發酵溫度32 ℃，發酵時間40 h，該條件下樣品的吸光度值為0.413，黃糙米中GABA含量為0.456 mg·mL-1。

3 結論

本試驗以黃色糙米為原料，以糙米酵素中GABA含量為評價指標，選取酵母菌的接種量、發酵時間、發酵溫度為考察因素，進行單因素及正交試驗。結果表明，酵母菌發酵黃糙米的最佳工藝為接種量2%，培養時間40 h，培養溫度32 ℃，該條件下GABA含量為0.456 mg·mL-1。該試驗可為提高糙米的綜合利用率和附加值，以及有色糙米酵素的實際生產應用提供依據[12-14]。

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