親吻素在青藏高原牦牛睪丸組織中的表達及定位研究

丁艷平 趙越 張晉平 馬佳樂

DOI：10.16783/j.cnki.nwnuz.2024.01.011

收稿日期：20230710;修改稿收到日期：20230928

基金項目：國家自然科學基金資助項目（31760271）

作者簡介：丁艷平（1980—），女，甘肅會寧人，副教授，博士，碩士研究生導師.主要研究方向為動物生理學.

Email：dingyp05@163.com

摘要：親吻素（Kisspeptin）通過下丘腦-垂體-性腺軸對動物繁殖起重要的調控作用.為了探討親吻素在牦牛精子發生中的生理功能及其對高原環境的適應機制，文中對比研究了牦牛和黃牛睪丸的組織學特征及其親吻素的表達情況.結果表明，與黃牛相比，牦牛的曲細精管不飽滿，除精原細胞外，牦牛初級精母細胞、次級精母細胞、早期/晚期精子細胞以及精子的數量都顯著少于黃牛（P＜0.01）.免疫組織化學結果顯示，在牦牛的精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、早期精細胞及基質細胞中都可見Kisspeptin免疫陽性產物的表達，這與黃牛表達位置一致，但是牦牛睪丸中陽性產物光密度值（IOD）卻顯著高于黃牛；牦牛睪丸組織中Kisspeptin蛋白的表達顯著高于黃牛（P＜0.01）.該結果暗示Kisspeptin可能作為負調控因子，參與維持牦牛精子發生和精子成熟過程中的正常組織結構及其微環境生理狀態.

關鍵詞：牦牛；睪丸；親吻素；Kiss-1陽性產物；精子發生

中圖分類號：S 826??? 文獻標志碼：A??? 文章編號：1001-988Ⅹ（2024）01-0070-06

Histology and kisspeptin expression in the

testis of the Tibetan Plateau yak

DING Yan-ping，ZHAO Yue，ZHANG Jin-ping，MA Jia-le

（College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，Gansu，China）

Abstract：Kisspeptin plays an important role in animal reproduction through the hypothalamic-pituitary-gonadal axis.In order to investigate the physiological function of kisspeptin in yak spermatogenesis and its adaptation mechanism to plateau environment，the histological characteristics and expression of kisspeptin in testis of yak and cattle were compared.The results showed that compared with cattle，the number of primary spermatocyte，secondary spermatocyte，early/late spermatocyte and spermatocyte in yak are significantly lower than that in cattle（P＜0.01）.Immunohistochemical results showed that kisspeptin immunopositive products are expressed in spermatogonium，primary spermatocyte，secondary spermatocyte，early spermatocyte and stromal cell of yak，which are consistent with the expression position of cattle，but the IOD value of positive substances in testis of yak is significantly higher than that of cattle.The expression of kisspeptin protein in the testicular tissue of yaks is significantly higher than that of cattle（P<0.01）.The results showed that kisspeptin，as a negative regulator，is involved in maintaining the normal tissue structure and microenvironmental physiological state of yak spermatogenesis and sperm maturation.

Key words：yak；testis；kisspeptins；Kiss-1 positive product;spermatogenesis

親吻素（Kisspeptin）是由Kiss-1基因編碼的一組多肽，其在哺乳動物生殖內分泌系統中發揮著重要的調節作用［1-2］.現在已經清楚，Kiss-1主要由下丘腦神經元分泌，通過刺激促性腺激素釋放激素（GnRH）神經元細胞上同源的G蛋白偶聯受體54（GPR54）發揮作用，進而調節初情期生殖功能相關的下游基因.已有研究表明，大鼠和人被注射 Kiss-1基因的表達產物親吻素后，可以迅速促進黃體生成素和睪酮水平的升高［3-4］.親吻素可以推動青春期的啟動，維持正常的生殖能力，而且Kiss-1在中樞神經系統和生殖器官中均有表達，與生殖功能密切相關.馮俊鵬等［5］研究發現，大鼠睪丸中Kiss-1/GPR54的表達在生殖周期的不同階段表達存在時序性，表明其在大鼠生精細胞成熟的過程中起著一定的調節作用.劉紅羽等［6］發現Kiss-1也表達在山羊附睪中，說明Kiss在精子發生和精子保存過程中可能起著重要作用.荀文娟等［7］發現，Kiss-1的陽性免疫反應產物表達在五指山豬的睪丸間質細胞、精原細胞、初級和次級精母細胞、圓形精子細胞中；而在精子中，Kiss-1的陽性表達產物卻未被發現，表示Kiss-1在精子發生過程中發揮著重要作用.上述研究表明，Kiss-1在雄性哺乳動物的生殖與發育相關調控機制中具有重要作用.

牦牛（Bos grunniens）是青藏高原地區特有的一種全年放牧動物，對高原高寒、低氧、枯草期長等惡劣條件有極高的適應性.牦牛是一種季節性發情動物，為了使繁殖成功率最大化，會選擇在氣候溫暖、牧草豐茂的暮夏或秋季（6月～10月）發情，但其繁殖性能較低［8］.與之生存環境不同，黃牛是一種全年發情的物種，而Kiss-1在牦牛和黃牛睪丸組織內的表達是否有差異，目前尚未見相關報道.

本研究以牦牛作為研究對象，通過與黃牛做對比，對其睪丸中的Kisspeptin進行定性、定位和定量研究，以便探討Kiss-1在睪丸精子發生、雄激素合成和分泌中的生理作用，為研究Kiss-1/GPR54系統對牦牛的季節性發情的調控機制提供基礎資料.

1? 材料和方法

1.1? 組織采集與處理

牦牛組織樣品取自甘肅省天祝藏族自治縣屠宰場（海拔約3 500 m），黃牛組織樣品取自甘肅臨夏屠宰場（海拔約1 300 m）.所采樣本均為健康的4頭成年（3～4歲）公牛，平均體重為220 kg.牛被處死后立即取其睪丸組織，固定于40 g·L-1的多聚甲醛中，于4 ℃保存備用.

1.2 ?免疫組織化學染色

應用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法（SP法）檢測睪丸中相關蛋白的表達［9］.經固定的睪丸組織進行常規石蠟切片（片厚5 μm），使用梯度酒精對切片脫蠟，用檸檬酸鈉進行熱修復，滴加 H2O2 溶液（3%）去除內源性過氧化物酶的影響，再經山羊血清封閉，滴加兔抗Kiss-1（1∶200，Boster）.在陰性對照組中，以PBS緩沖液代替一抗，4 ℃孵育過夜，用免疫組化試劑盒依次進行二抗 、三抗孵育，經二氨基聯苯胺法（DAB法）顯色后，進行復染和封片.

1.3? Western blot檢測

提取睪丸總蛋白，采用比辛基奎寧酸（BCA）蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度.含等量蛋白（20 μg）的樣品在蛋白上樣緩沖液中煮沸3 min，用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離，轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上.用5%脫脂牛奶在PBS中封閉1 h后，用抗Kiss-1多克隆抗體（1∶1000）在5% BSA中在4 ℃孵育過夜.次日，TPBS洗滌PVDF膜3次，每次10 min；二抗室溫搖床孵育 2 h，TBST 清洗 3 次，每次 10 min.增強型化學發光試劑（ECL）檢測液放射自顯影，用凝膠系統成像儀采集圖像.結果用 Image J 進行條帶分析.

1.4? 數據統計

在組織切片中隨機選擇5張，并在每個切片中隨機選擇10個區域在Olympus顯微鏡下拍照.牦牛和黃牛睪丸中各種類型細胞的鑒定依據文獻［10］進行；免疫組織化學切片以胞漿內發現棕褐色顆粒的細胞作為陽性細胞，分析間質細胞、精原細胞、初級和次級精母細胞以及精子細胞的陽性表達，每張切片在固定光亮度下，隨機選取5個視野，采用Image-Plus Pro 6.0軟件分析，計算出每張照片的IOD值.所有數據采用SPSS-17.0進行t-檢驗及單因素方差分析，P<0.05為顯著差異，P<0.01為極顯著差異，各組數據以均值±標準差表示.

2? 結果

2.1? 牦牛睪丸組織結構

牦牛睪丸有間質細胞、支持細胞、精原細胞、初級和次級精母細胞、精子細胞、血管以及結締組織等，結構見圖1.從圖1可以看出，牦牛的睪丸組織要比黃牛更加松弛，并且曲細精管也不如黃牛的飽滿（圖1A，A1，B，B1）；精母細胞和精子細胞的數量皆少于黃牛（P＜0.01），而牦牛精原細胞和支持細胞的數量與黃牛基本一致（圖2）.

2.2? Kiss-1陽性免疫反應產物在睪丸組織中的表達

對牦牛和黃牛睪丸組織 Kiss-1的陽性表達進行觀察（圖3），可見在牦牛睪丸實質內的精原細胞、初級和次級精母細胞及精細胞（早期）中均有Kiss-1陽性免疫反應產物的表達，而在晚期精子細胞、精子以及支持細胞中無棕色陽性產物；在睪丸間質中，陽性產物僅在間質細胞中表達，在間質的血管和其他細胞中未發現陽性反應產物.黃牛的表達位置特征與牦牛一致.對牦牛睪丸 Kiss-1陽性反應產物的平均吸光度進行分析（圖4），發現IOD值從高到低順次為：初級精母細胞、次級精母細胞、精原細胞、精子細胞（早期）;黃牛的IOD值表達趨勢與牦牛一致，然而牦牛睪丸內陽性細胞IOD值顯著高于黃牛陽性細胞相應的IOD值.

2.3? 牦牛睪丸組織中 Kisspeptin 蛋白的表達

采用western blot分析Kisspeptin 蛋白在黃牛和牦牛睪丸組織中的表達狀況，并以NAPDH為內參蛋白（圖5）.結果表明Kisspeptin 蛋白在牦牛和黃牛睪丸組織中均有表達，但在牦牛的睪丸組織中表達量極顯著高于黃牛組織（P<0.01）.

3? 討論

動物的生殖過程需要耗費能量，因此在機體能量不足或能量過剩時，都會通過下丘腦-垂體-性腺軸（HPG）軸影響生殖功能，而Kiss-1神經元作為生殖和能量平衡的連接節點，機體能量狀態的變化可能也會通過Kiss-1系統間接影響動物生殖相關的行為［11］.本研究結果表明，除了精原細胞外，牦牛睪丸中生殖細胞和精子的數量均顯著少于黃牛睪丸中的相應細胞數量（P＜0.01），曲細精管也不如黃牛的飽滿，這可能與牦牛生存的高原環境營養匱乏有關.

精子的發生在雄性哺乳動物的生殖過程中體現出高度的協調性，其過程要經過精原細胞的有絲分裂、精母細胞的減數分裂和精細胞通過形態變化成為成熟精子三個階段［10］.Sethu等［12］研究發現，Kiss-1在生精細胞的發育過程中呈現差異性表達，從精細胞成熟的整個過程來看，Kiss-1的表達呈逐漸下調趨勢.Ramzan等［13］用1 μg的Kisspeptim-10處理大鼠后發現生精細胞的有絲分裂系數顯著增加，而減數分裂指數顯著減小，與之對應的是A型精原細胞、早期精母細胞以及精子細胞的數量都顯著降低.間質細胞具有合成、分泌雄性激素、產生生長因子及生物活性物質的功能，起到局部調節精子成熟微環境的作用［10］.有研究證實Kisspeptin的過表達可以顯著抑制大鼠體內雄性激素（如睪酮）的分泌和血漿中黃體生成素（LH）的含量，并進一步抑制睪丸發育；其早期精子細胞數量和生殖細胞總數與支持細胞的比值均顯著下降，表明支持細胞的效率和總支持能力的比值降低，最終對性腺軸發揮負調控作用［14-15］.還有研究表明，Kiss-1對動物睪酮的分泌調控作用強于芳烴受體核轉位蛋白1（BMAL1）、腦源性神經營養因子（BDNF）以及瘦素（Leptin）等因子［16-21］.目前關于不同物種的睪丸中Kiss-1/GPR54表達定位研究結果存在一些爭議，例如王雪松等［22］研究發現，大鼠的間質細胞中并沒有表達Kiss-1陽性產物，但是大部分研究支持生長期大鼠的睪丸和間質細胞中有Kiss-1的表達［5］，而且從出生到衰老各階段小鼠睪丸中Kiss-1 的表達定位呈周期性分布［23］.這說明在生殖周期的不同階段Kiss-1/GPR54系統在睪丸中的生理功能可能有所不同.本實驗中，在成年牦牛的睪丸組織中，Kiss-1免疫反應陽性產物在精原細胞、初級和次級精母細胞以及早期精子細胞中均得到表達，而且在間質細胞中也出現了Kiss-1陽性產物，但是其Kiss-1陽性IOD值在生精細胞的成熟過程中具有表達差異，而黃牛的陽性產物表達位置和IOD值與牦牛一致.但是值得注意的是，牦牛睪丸內陽性細胞IOD值顯著高于黃牛陽性細胞相應的IOD值，說明Kiss-1作為一個負調節因子參與了牦牛生精細胞的調控，

也可以解釋牦牛的季節性發情和黃牛的常年發情的生理現象可能受到了體內Kiss-1的表達調控.

綜上所述，Kiss-1在牦牛的實質和間質細胞中均有表達，且Kisspeptin及其表達產物在牦牛睪丸組織中顯著提高，暗示Kiss-1作為一個負調控因子，可能在精原細胞有絲分裂和精母細胞減數分裂中起著重要的調控作用，可能參與了牦牛睪丸間質細胞雄性激素的合成和分泌來維持精子成熟的微環境生理狀態以及正常組織結構，以適應其特有的生存環境.

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（責任編輯? 陸泉芳）