差示掃描量熱分析法在藥物熔點測定實驗中的應用

陳 艷,李文戈,曹鳳龍,梁麗麗,張恩立

(蚌埠醫學院公共基礎學院,安徽 蚌埠 233030)

差示掃描量熱(DSC)分析法是一種熱分析技術,用于測量在程序控溫下,輸給物質和參比物的功率差(如以熱的形式)與溫度的關系。差示掃描量熱分析法在材料科學、化學、生物醫學等領域有著廣泛的應用[1-2]。在生物醫學領域,通過DSC技術可以研究蛋白質的變性/復性過程、DNA的熔解曲線等,了解生物分子的熱穩定性、相變行為,對于研究生物分子的結構和功能具有重要意義。在藥物合成領域,DSC可以應用于甄別化學藥物、檢測藥物的理化常數、測定藥物純度、對藥物穩定性進行考查[3]。此外,在藥品檢驗工作中,還可以采用DSC技術進行原料藥熔點的測定、化學對照品的純度測定、藥物水分的測定,實現藥物質量的控制,有助于優化合成工藝和提高藥物的質量[4-5]。

目前,各大醫學院校開設了多種藥物合成實驗,包括阿司匹林、磺胺醋酰鈉、美沙拉嗪、苯佐卡因、蘆丁和香豆素的合成等。學生在實驗前期,需要經過對所需合成藥物的結構、性質、用途以及現有合成方法進行調研,然后確定合適的合成路線和反應條件,以此為基礎進行實驗操作,得到目標產物的粗產物。最后,需要對粗產物進行純化,并對其結構、性質、純度等進行鑒定。對不同的藥物,最終產品純度的鑒定方法不同,可以有熔點的測定、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、紫外可見光譜法(UV-Vis)和電泳法。根據藥品的性質、用途和實驗條件等因素,為藥品純度的鑒定篩選不同的測定方法。其中,熔點測定法是較為廣泛使用的評估手段。通過藥物熔點的測定,可以了解藥品的純度、結晶度和雜質含量等信息,從而評估藥品的質量[6-7]。如通過測試結果發現熔點發生下降,可以推測出藥品中存在雜質或結晶度有所降低。因此,熔點測定在藥品質量控制中具有重要的作用。在學生綜合實驗中加入產物熔點的測定,可以讓學生對制備的樣品的純度有更感性的認識。目前,藥物熔點測定的方法主要包括毛細管法和熱分析法。其中,毛細管法是《中國藥典》中最為經典的測定方法,其操作簡便,用量少,實驗步驟相對簡單,對于某些難溶于溶劑的藥品,毛細管法可以有效地避免藥品的損失和浪費。因此,毛細管法對藥物熔點的測定易在本科教學中廣泛開展。目前,醫學院校醫學化學實驗課程“熔點的測定”實驗均采用毛細管測定法,已經面向臨床、檢驗、兒科、精神等十幾個專業開設,受眾面廣。然而,毛細管法在測定藥品熔點時存在一些不足,如實驗結果的重現性相對較差,可能會受到多種因素的影響,如溫度、壓力、毛細管的材質和尺寸等;對于某些具有相同或相似熔點的藥品,存在人為視覺上的誤差;此外,對于某些高溫易分解的藥品,毛細管法可能無法準確測定其熔點。總而言之,毛細管測定法的測試手段過于陳舊和落后,數據準確度不高,無法滿足現代科技的發展和行業需求。而DSC法作為現代先進的檢測手段,具有更為準確、快速、重復性好等特點,可以通過程序升溫客觀地記錄熔融的全過程,相對于毛細管法呈現出特有的優越性。因此,有必要在本科教學工作中引入DSC對藥物熔點進行測定,提高實驗的準確性和效率,以保證藥品的質量。

苯佐卡因(Benzocaine),化學名為對氨基苯甲酸乙酯,是一種局部麻醉藥,具有止痛的功效,可以用于治療各種原因引起的局部疼痛,例如關節痛、神經痛、偏頭痛等。“苯佐卡因的合成”是一門綜合性實驗課程,已面向本科院校中的藥學、藥物分析、制藥工程等專業的本科生開設。在合成操作完成后,主要通過標準物TLC對照法和紅外光譜分析法對所制得的藥品進行檢測,可以增加DSC法進行熔點的測定。本文以該綜合實驗制備出的苯佐卡因藥物為例,探討熱分析技術在藥物合成實驗教學過程中的應用以及注意事項。通過采用現代化的檢測手段對熔點進行科學的測定,既豐富了實驗內容,提高學生的學習興趣,又可以使學生更好地與現代的科學研究接軌,對藥物純度的鑒定有正確認識。

1 苯佐卡因的合成

經過文獻調研,苯佐卡因可以通過四種途徑進行合成:(1)以對甲基苯胺為原料,經過酰化、氧化、水解和酯化得到苯佐卡因;(2)先用硫酸亞鐵還原對硝基苯甲酸,得到對氨基苯甲酸,再與無水乙醇在酸性條件下酯化得到苯佐卡因;(3)酯化與還原并為一步進行;(4)對硝基苯甲酸在濃硫酸的催化下先酯化生成對硝基苯甲酸乙酯,再經過鐵粉還原得到苯佐卡因。綜合考慮反應時長、收率和成本等幾方面因素,最終確定用第四種途徑進行苯佐卡因的制備。反應方程式如圖1所示。

圖1 苯佐卡因合成反應方程式

反應分為兩步進行:第一步,對硝基苯甲酸乙酯的制備。在24 mL無水乙醇中加入6.0 g對硝基苯甲酸;在攪拌和冰水浴冷卻下緩慢加入2 mL濃硫酸,加熱回流4 h;稍冷卻后,攪拌往燒瓶加入100 mL水,減壓蒸去乙醇后進行抽濾。濾餅移至研缽內,研細后用碳酸鈉水溶液調pH值至7.5～8.0,抽濾,濾餅用水多次洗滌,干燥即可得對硝基苯甲酸乙酯。第二步,苯佐卡因的制備。在三頸瓶中加入NH4Cl溶液,迅速加熱至95 ℃,加入鋅粉4.3 g,在90～98 ℃下活化20 min。然后慢慢加入5 g對硝基苯甲酸乙酯,在95～98 ℃反應90 min。冷卻后,加入少量飽和碳酸鈉溶液調pH值至7～8,加入氯仿30 mL,攪拌3～5 min,抽濾并洗滌。將濾液傾入分液漏斗中,靜置分層,棄除水層,氯仿用5%稀鹽酸90 mL分三次提取、分液,合并提取液(水層),用40%NaOH溶液調至pH值為8,析出結晶,抽濾,得苯佐卡因粗品。粗品以50%乙醇重結晶,得苯佐卡因純品。

2 DSC法測定苯佐卡因熔點

2.1 DSC測試條件的確定

2.1.1 儀器參數的設置

DSC采用同步熱分析儀(STA449-F5)進行測試。測試溫度范圍0～400 ℃;樣品用量3.5 mg。

DSC在實際熱分析過程中,一般會采用與樣品和坩堝不反應的惰性氣體作為氣氛,以保護傳感器,防止樣品在加熱過程中被氧化,避免樣品受熱分解后的產物腐蝕測量池。實驗過程中氣氛流量要保持穩定,不穩定的氣流會造成基線波動,氣氛氣流量一般為20～100 mL/min。因此,本次測試使用氮氣為保護氣,分別采用30 mL/min 和50 mL/min的氣體流量對樣品的熔點進行測定分析,讓學生對不同流量對測試結果的影響有感性認識。

升溫速率是影響檢測結果的重要因素。對不同的藥物可調整不同的升溫速率。對于熔融效應比較明顯的藥物,較低的升溫速率可以提高實驗的準確度,但相應的測試時間也會增加。對于在熔融過程中存在分解現象的樣品,即不穩定的樣品,可能導致純度和熔點值降低。本次測試分別采用5 K/min和10 K/min的升溫速率對樣品的熔點進行測定分析,讓學生對不同升溫速率對測試結果的影響有感性認識。

2.1.2 測試注意事項

為確保實驗結果的準確性,在進行DSC測試前,儀器需先進行空燒,用標準物質校正儀器,包括溫度校正和儀器校正。正式測試時,需要提醒學生確保樣品是干燥的,以避免水分對測試結果的影響。同時,樣品需要進行充分的研磨,盡量不產生靜凝結塊,盛裝樣品時與坩堝底部接觸充分。將樣品平鋪在坩堝底部,輕輕壓緊,將死體積減到最小。操作過程中,需要提醒學生不能用手接觸坩堝,避免手上的油脂沾染坩堝導致測量數據的偏差。還應避免用硬物清理樣品托及實驗區,若有灰塵或粉末可用洗耳球吹干凈。

2.2 數據處理

用差示掃描量熱儀軟件進行譜圖分析,導出Excel數據,用Origin2021軟件,以溫度T(℃)為橫坐標,以單位重量樣品在某個溫度下所造成的熱電偶的電位差DSC(μV/mg)為縱坐標進行繪圖。

3 結果與分析

通過DSC進行熔融測試時,隨著程序的升溫,物質在熔融區間會出現明顯的吸熱現象。圖2中顯示出兩個向上的吸熱峰。其中,圖2為固定氣體流速30 mL/min,升溫速率分別為5 K/min和10 K/min下測得的DSC曲線。

圖2 氣體流量30 mL/min,升溫速度分別為5 K/min和10 K/min

可以看出,升溫速度為10 K/min時測得的吸收峰的峰形較大,特征峰的溫度會向高溫移動,相鄰峰的分離能力下降,5 K/min的升溫速度將有利于相鄰峰的分離。而當固定升溫速率不變,均為10 K/min時,不同的氣體流速對特征峰的位置沒有影響,但對相鄰峰的分離能力有影響,如圖3所示。流速大時,更有利于分離。基于此,我們選擇在較慢的升溫速率,即5 K/min,氣體流速為30 mL/min的條件下對苯佐卡因的DSC曲線測繪,并進行熔點數據的分析,結果如圖4所示。

圖3 升溫速度10 K/min,氣體流量分別為30 mL/min和50 mL/min

圖4 苯佐卡因在5 K/min的升溫速度,30 mL/min的氣體流量下測得的DSC曲線

熔點是指物質從固態轉變為液態時所對應的溫度。在對固體物質進行加熱時,隨著溫度的逐漸升高,該物質會吸收熱量而出現部分固體融化(初熔)的現象。隨著受熱時間的延長,吸收熱量的增多,越來越多的固體物質向液態進行轉化,最終所有的固體物質熔融轉化為液態(全熔)。如圖4所示,將DSC曲線中基線的切線延長,與對應于吸熱峰轉變開始的曲線最大斜處所作切線相交,交點對應的溫度稱為初熔時的熔點(初熔點)T1。而當溫度繼續升高,固體受熱進一步熔融,到吸熱峰峰谷時,固體剛好完全融化全部熔融,所對應的溫度稱為終熔點T2。熔點為初熔點與終熔點的平均值。由此,可以從圖3中得出苯佐卡因的T1為154 ℃,T2為176 ℃,熔點為165 ℃。結合上文對圖2的分析,升溫速度的變化會對特征峰的峰形有影響,隨著升溫速率的增加,特征峰向高溫移動,即T2變大向高溫移動,而T1的數值變化不大。這是因為在達到初熔溫度值后,爐體溫度不是恒定不變的,一直以一定的升溫速率增加,而樣品融化總是需要一定的時間,在融化的過程中,爐體溫度一直以較快的速度在增加,導致固體完全融化時設備在短時間內升高到較高的溫度,測得的T2偏大。由此可見,在不同的測試條件下,T1較為穩定,一般不會發生變化,而T2隨著測試條件的變化而變化。教師在指導學生通過DSC測藥物的熔點時,需要提醒學生保持每次測試條件要一致,否則會導致測試結果偏差,無可比性。

4 結語

熔點測定對藥物質量的鑒定具有重要作用,是藥物合成實驗中不可或缺的檢測步驟。鑒于學生實驗中使用的毛細管測定熔點的方法過于陳舊,測出的熔點誤差較大,本文以學生綜合實驗制備得到的苯佐卡因樣品為例,通過差示掃描量熱法對其進行熔點測定和數據分析。現代化檢測設備在本科實驗教學中的應用,使學生能夠快速完成檢測任務,縮短實驗周期,提高實驗效率的同時,還能夠自主進行實驗操作和數據分析,可以更好地理解科學原理和實驗內容,提高實踐能力,促進實驗教學和科研的融合,并推動學科建設和實驗室發展。