楊樹KT、HAK、KUP基因家族鑒定及鉀肥處理對楊樹生長的影響1)

安偉 張玲玲

(西北農林科技大學,楊凌,712100)

鉀元素是植物生長發育過程中必不可少的礦質元素之一,在植物生長發育過程起著重大作用。鉀參與植物體內許多重要的生理生化過程,如促進植物基礎生理代謝、調節氣孔運動,促進光合作用、維持陰陽離子平衡、調節滲透壓等[1],對植物整個生命周期至關重要。此外,鉀元素在植物鹽脅迫適應、耐干旱脅迫、有機酸物質長距離運輸、氮素利用、糖分累積方面都發揮了重要作用[2-3]。鉀缺乏則會導致植物老葉加速黃化,根系短小且易倒伏[4]。植物吸收鉀離子主要依靠鉀轉運蛋白和鉀離子通道。目前研究表明,參與植物體內K+吸收及轉運的蛋白或通道共有5類：KT、HAK、KUP家族轉運蛋白、HKT家族轉運蛋白、CPAs家族轉運蛋白、Shaker通道和TPK通道[5]。其中,KT、HAK、KUP家族是一類數量眾多的基因家族,廣泛分布于細菌、真菌和植物中[6]。目前從擬南芥(Arabidopsisthaliana)鑒定出13個KT、HAK、KUP相關家族基因[7],水稻(Oryzasativa)中27個基因[8],紫柳(Salixpurpurea)中22個基因[9],玉米(Zeamays)27個基因[10],番茄(Solanumlycopersicum)19個基因[11],茶樹(Camelliasinensis)21個[12],鉀轉運蛋白在不同物種中有較為廣泛的分布,但也存在較大的功能分異。

KT、HAK、KUP家族分為5個亞族,亞族Ⅰ主要包括擬南芥AtHAK5、水稻OsHAK5等;亞族Ⅱ主要包括擬南芥AtKUP1、AtKUP2等;亞族Ⅲ主要包括擬南芥AtKUP9、AtKUP10等;亞族Ⅳ主要包括水稻OsHAK4和OsHAK17;亞族Ⅴ主要包括AtKUP5、AtKUP7等[13]。亞族Ⅱ和亞族Ⅲ的成員在雙子葉和單子葉植物中的分布相似,表現出很強的保守性。亞族Ⅰ和Ⅳ的成員則與之相反,在多種雙子葉植物如擬南芥(Arabidopsisthaliana)、葡萄(Vitisvinifera)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)和單子葉植物如水稻、玉米和短柄草(Brachypodiumsylvaticum)中都有所體現[14-16]。KT、HAK、KUP轉運體家族成員定位在植物不同細胞器的膜上,如質膜、液泡膜和類囊體膜[17-18]。同一簇的家族成員細胞定位也并不相同,因而可能發揮不同的細胞生物學功能。如簇Ⅱ成員AtKUP4定位于液泡膜,OsHAK2定位于細胞質膜,而OsHAK10定位于液泡膜等。在鹽脅迫條件下,水稻中的高親和性K+轉運體OsHAK1、OsHAK5和OsHAK21在轉運K+方面表現出不同的能力。這種差異不僅與它們所處的細胞位置有關,還與它們在不同組織中的表達特異性以及根細胞膜電位的變化相關。目前K+轉運蛋白功能研究主要集中在擬南芥、水稻中,楊樹中的研究還有待進一步深入。

楊樹分布廣泛,速生、抗逆性強,是我國最為重要的用材樹種,西北楊2號(Populusalba×P.tomentosa‘Xibeiyang 2’)為西北農林科技大學新培育的楊樹速生優質新品種,可廣泛應用于北方楊樹造林。在楊樹優質大徑材培育中鉀元素的缺乏是影響其速生豐產的關鍵因素之一。KT、HAK、KUP家族是植物吸收和轉運鉀的關鍵蛋白家族,影響植物生長發育和抗逆能力,對楊樹產量性狀形成起到重要的調控作用?；诖?本研究以毛果楊的基因組數據庫為基礎,結合生物信息學方法鑒定楊樹KT、HAK、KUP基因,同時對該家族成員開展理化性質分析,構建系統進化樹、染色體定位,開展基因結構、保守基序分析;結合實時熒光定量PCR方法分析楊樹KT、HAK、KUP基因在不同鉀肥(KCl)濃度處理下表達情況。研究KT、HAK、KUP基因家族在楊樹中的分類與表達不僅可以幫助我們更好地了解這些基因在楊樹生長發育調控中的功能和作用,而且可以為今后楊樹改良和高效鉀吸收的楊樹品種篩選鑒定提供理論基礎。

1 材料與方法

試驗所用楊樹材料為西北農林科技大學渭河實驗站西北楊2號無性系。于西北農林科技大學科研溫室利用水培法培養1年生扦插苗,選取長勢均勻一致的扦插苗分成4組,分別使用含有0.1、0.5、1.0、3.0 mmol/L KCl的Hoagland溶液澆灌,每4 d更換1次營養液,45 d后測定各處理楊樹株高。

楊樹KT、HAK、KUP基因家族的全基因組鑒定。Phytozome(https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/)在線數據庫下載毛果楊基因組fa文件,注釋gff文件及蛋白質protein文件,利用TBlools工具提取楊樹基因組的CDS序列,參數設置為Parent。從Pfam(http：//pfam.xfam.org/)數據庫下載HAK蛋白特征結構域K-Trans(PF02705)的隱馬爾可夫模型[19],利用HMMER軟件在比對的假陽性預期值E<1×10-5條件下進行楊樹KT、HAK、KUP基因家族成員初步篩選。將篩選得到的數據在CD-HIT中進一步處理。去除重復成員。最后使用CCD(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)進行蛋白結構域驗證。

楊樹KT、HAK、KUP基因家族理化性質。使用ExPASy在線網站(http：//www.expasy.org)查找獲得楊樹KT、HAK、KUP基因的相對分子質量、氨基酸數量、不穩定系數等理化性質。通過WoLF PSORT網站(https：//wolfpsort.hgc.jp/)對楊樹KT、HAK、KUP基因進行亞細胞定位預測。

楊樹KT、HAK、KUP基因系統進化樹。在擬南芥數據庫(https：//www.arabidopsis.org/)獲取KT、HAK、KUP基因家族成員信息。利用ClustalX2對楊樹和擬南芥KT、HAK、KUP蛋白進行氨基酸多序列比對。使用MEGA11軟件運用比鄰法獲得最優進化模型,構建系統發育進化樹,默認參數為1 000次Bootstrap重復。利用ITOL(https：//itol.embl.de/)對進化樹進行美化。

楊樹KT、HAK、KUP基因家族染色體定位及共線性。利用TBtools工具對鑒定篩選出的楊樹KT、HAK、KUP家族基因進行染色體定位,并根據各基因在染色體上位置順序的比較結果,對預測的KT、HAK、KUP基因進行命名。利用多重共線性掃描工具包(MCseanx)分析楊樹與簸箕柳之間共線性關系。

楊樹KT、HAK、KUP基因家族基因結構與保守基序。采用在線軟件GSDS(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/)、MEME(http：//meme-suite.org/tools/meme)分別分析該家族成員基因結構和編碼蛋白保守基序[20](基數參數為15,其余為默認),并用TBtools進行展示。

楊樹KT、HAK、KUP基因家族順式作用元件。提取鑒定篩選出的楊樹KT、HAK、KUP基因上游2 000 bp的CDS序列提交至PlantCARE在線網站進行順式元件作用分析[21]。

1.1 光響應曲線測定

在楊樹不同K+濃度處理15 d時,于09：00-12：00,使用便攜式光合儀LI-6400XT(LI-COR,美國)采用自動可調人工光源,分別測定自然CO2摩爾分數(380 μmol·mol-1)下,光合有效輻射為0、20、50、100、200、400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600、1 800 μmol/(m2·s)時楊樹葉的光強-光合響應曲線。利用光合響應曲線分析計算光飽和時最大凈光合速率(Pnmax)、暗呼吸速率(Rd)。

1.2 根葉RNA提取與反轉錄

采集不同K+濃度處理后1、5、15 d時的葉、根樣品,采用Omega RNA提取試劑盒提取根葉的RNA。采用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒反轉錄RNA獲得cDNA用于qRT-PCR。

1.3 熒光定量分析

使用軟件Primer Primer 5對楊樹PTHAKs基因進行cDNA特異性引物設計,設計擴增產物長度150～250 bp,退火溫度Tm值為55 ℃,引物信息如表1。以Actin為內參基因,2×Sybr Green qPCR Mix熒光定量試劑進行熒光定量試驗。qRT-PCR反應體系25 μL,包括2×Sybr Green qPCR Mix12.5 μL、cDNA模板1.0 μL、正反向引物各0.5 μL、雙蒸水10.5 μL。PCR程序：94 ℃預變性2 min、90 ℃變性20 s、55 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s、40個循環。使用2-ΔΔCt法[22]計算PTHAKs相對表達量。

表1 PTHAKs實時熒光定量引物信息

2 結果與分析

2.1 楊樹KT、HAK、KUP基因家族

通過對毛果楊基因組的篩選與鑒定,共獲得20個PTHAK家族成員,根據基因在染色體上的位置信息依次命名為PTHAK1～PTHAK20。蛋白基本理化性質分析結果表明(表2)：PTHAKs長度介于610～860個氨基酸,蛋白分子質量介于67 065.88～95 442.98 u,平均分子質量為86 424.98 u。等電點介于5.30～9.16,75%成員的等電點處于堿性區間,表明大部分PTHAK蛋白含堿性氨基酸數量多。不穩定系數介于32.59～45.49,其中14個PTHAKs成員為穩定性蛋白,6個成員為不穩定性蛋白。所有PTHAKs蛋白成員都屬于疏水性蛋白。根據亞細胞定位預測結果顯示,PTHAKs主要位于細胞質膜上,這和PTHAKs負責鉀元素轉運的作用密切相關。

表2 楊樹PTHAKs成員理化性質

2.2 楊樹KT、HAK、KUP蛋白序列系統進化樹

將13個擬南芥AtHAKs、20個楊樹PTHAKs成員蛋白序列進行多重序列比對和系統進化樹構建。結果(圖1)顯示楊樹20個HAKs家族成員被分為5個亞家族,其中PTHAK1、PTHAK2、PTHAK18屬于第Ⅰ家族,PTHAK17、PTHAK19、PTHAK20、PTHAK15分屬于第Ⅱ亞家族,PTHAK8、PTHAK3、PTHAK7分屬第Ⅲ亞家族,PTHAK12、PTHAK10、PTHAK11等6個成員分屬第Ⅳ亞家族,其余4個成員分屬第Ⅴ亞族。

圖1 擬南芥和楊樹KT、HAK、KUP基因家族系統進化樹

2.3 楊樹KT、HAK、KUP基因家族染色體定位及共線性

楊樹PTHAKs基因家族成員的染色體定位結果(圖2)表明：20個PTHAKs基因成員不均勻分布在1、2、3、5號等10條毛果楊染色體上。其中：5號染色體上分布最多,有5個成員;3號染色體有4個成員;8、10號染色體上均有2個PTHAKs成員;2、5、9、12、14、15、19號染色體均只有1個PTHAK成員。利用簸箕柳和楊樹進一步分析種間共線性關系(圖3),楊樹與簸箕柳構成20對共線性關系,分別位于1、2、3、8、9、10、12、14、15、19號染色體上。

圖2 楊樹PTHAKs基因家族染色體分布

灰色區域是毛果楊與簸箕柳基因組間共線性,紅色區域代表HAKs基因位置。

2.4 楊樹KT、HAK、KUP基因家族基因結構與保守基序

根據基因結構分析(圖4)：PTHAKs外顯子數7～10個不等,以8個居多。其中第Ⅳ、Ⅱ亞家族PTHAK11和PTHAK19具有9個外顯子,PTHAK15和PTHAK20具有7個外顯子;第Ⅴ亞家族PTHAK5具有10個外顯子,PTHAK4、PTHAK16、PTHAK13具有9個外顯子。

圖4 PTHAKs基因結構

使用MEME對PTHAKs家族保守基序分析(圖5),獲得15種基序(motif),命名為motif1～motif15。其中PTHAK12無motif14、motif15,PTHAK11無motif14,PTHAK19無motif13;PTHAK4無motif13、motif1,PTHAK13無motif14、motif7、motif15、motif12、motif11,PTHAK2無motif12、motif11,其余成員均有15種基序。

圖5 PTHAKs保守基序

2.5 楊樹KT、HAK、KUP基因家族順式作用元件

獲取楊樹KT、HAK、KUP基因家族啟動子上游2 000 bp區域,分析啟動子區域發現楊樹KT、HAK、KUP基因家族均存在TATA-box、CAAT-box、厭氧誘導、光信號響應的順式元件。此外,80%的成員包含赤霉素響應元件,70%的成員有脫落酸響應元件,75%的成員包含干旱誘導的MYB結合元件,45%的成員包含生長素響應等元件(圖6)。

圖6 PTHAKs成員啟動子區順式元件種類

2.6 楊樹植株高生長測定

為了探究K+對楊樹生長的影響,使用不同鉀素濃度處理西北楊2號無性系,測定植株高生長狀況。表3中記錄了在0.1、0.5、1.0、3.0 mmol/L KCl處理下楊樹的凈生長數據,4個濃度鉀素處理下樹高生長斜率分別是2.04、2.82、3.03、2.91,表明K+是影響楊樹生長的限制因素。缺鉀(0.1 mmol/L KCl)條件下,楊樹的生長顯著低于正常和高鉀處理,表明鉀素合理施用能夠有效提高楊樹的高生長。

表3 不同鉀素濃度時楊樹凈生長值

2.7 光響應曲線

由圖7可知4個不同鉀素濃度處理下,凈光合速率隨光合有效輻射增加的變化趨勢是相似的,在光合有效輻射(RPA)為0～1 000 μmol/(m2·s),凈光合速率(Pn)隨RPA增加而快速增加,在1 000 μmol/(m2·s)以上,凈光合速率增長趨于平緩。1.0和3.0 mmol/L KCl處理下,凈光合速率最大值高于其他處理,說明不同K+濃度處理對植物的光合作用有重大影響。

圖7 楊樹4種鉀濃度處理光響應特征

2.8 KT、HAK、KUP基因相對表達

通過對楊樹KT、HAK、KUP基因家族表達模式分析(圖8)發現,在葉片中PTHAK3、PTHAK15在所有鉀濃度處理中都有相對較高的表達豐度。PTHAK10、PTHAK13、PTHAK19在低鉀(0.1、0.5 mmol/L KCl)處理下出現相對較高表達情況。PTHAK5、PTHAK6、PTHAK7則是在高濃度鉀(1.0、3.0 mmol/L KCl)處理中有相對較高豐度表達。在根系組織中PTHAK3、PTHAK6、PTHAK15在所有鉀濃度中均有較高的表達豐度。PTHAK3、PTHAK5、PTHAK7、PTHAK13、PTHAK19等成員在低鉀脅迫下相對表達量最高。PTHAK6、PTHAK5、PTHAK7、PTHAK12、PTHAK15則是在高濃度鉀(1.0、3.0 mmol/L KCl)處理中存在較高豐度表達。以上結果表明不同PTHAKs家族成員在葉片和根系中的響應存在表達特異性。

圖8 楊樹KT、HAK、KUP家族成員不同鉀素濃度處理下表達模式

3 討論與結論

楊樹生長速度快,材積產出高,抗逆性較強是我國重要的防護林和工業用材林。培育大徑級楊樹是目前我國楊樹生產的重要目標。鉀元素是植物生長發育過程中必不可少的礦質元素,能夠促進植物基礎生理代謝,促進光合作用,增強植物逆境抗性等,對楊樹大徑級材生產起著關鍵作用。開展楊樹鉀響應以及鉀轉運調控研究對今后楊樹開展豐產栽培、楊樹遺傳改良具有重要意義。本研究從毛果楊全基因組數據為基礎,利用生物信息學方法對楊樹KT、HAK、KUP家族進行了全基因組學鑒定與生物信息學分析,同時以國審新品種西北楊2號為材料分析了楊樹對鉀素的生長響應。

研究在毛果楊全基因組中鑒定出來20個KT、HAK、KUP家族成員。預測分析其理化性質發現,KT、HAK、KUP基因蛋白序列長度在610～860個氨基酸,平均蛋白序列長度為775個氨基酸;等電點在5.30～9.16,75%成員都屬于堿性蛋白;親水性顯示該家族成員都為疏水性蛋白;預測亞細胞定位集中在細胞質膜上,研究結果印證家族基因鉀轉運蛋白基本特征。構建擬南芥和楊樹KT、HAK、KUP基因家族的系統進化樹,通過分析可知和擬南芥不同,楊樹KT、HAK、KUP基因家族可分為5個亞家族,這與多數HAK家族被劃分為5個系統進化簇類似?；蚪Y構及motif的分析表明,KT、HAK、KUP基因進化過程相對保守,幾乎所有成員都包含motif1-motif15,這與前人的研究結果一致[23]。順式作用元件分析結果顯示,KT、HAK、KUP基因家族成員含有許多與激素、逆境脅迫的響應元件,表明其還可能受到環境脅迫以及植物激素的調控與響應[24]。

設置了0.1、0.5、1.0、3.0 mmol/L 4個鉀肥(KCl)施用濃度處理來分析楊樹的生長情況。在對楊樹扦插苗凈生長測定分析發現,低鉀濃度處理顯著抑制了楊樹無性苗的高生長,說明鉀元素直接影響楊樹的高生長;同時對不同鉀素濃度處理的楊樹進行了光響應測定,分析可知在正常(1.0 mmol/L)和高鉀(3.0 mmol/L)處理下,凈光合速率最大值均高于低鉀處理,說明不同K+濃度處理對楊樹的光合作用有重大影響,而提高光合速率是實現楊樹大徑材培育的重要方式。

使用實時熒光定量技術檢測部分KT、HAK、KUP家族基因在楊樹根和葉中的表達情況。研究表明在低鉀脅迫下PTHAK10、PTHAK13、PTHAK15等成員在葉片中有較高表達;PTHAK5、PTHAK6、PTHAK7等成員在根系中有較高表達。在擬南芥的研究發現,缺鉀可以誘導AtHAK5的表達,在鉀離子濃度小于50 μmol·L-1時AtHAK5突變體種子萌發緩慢,根生長受抑制,鉀離子吸收能力降低[25]。另外在擬南芥中發現AtKUP4在根尖表達,通過改變生長素運輸來影響根尖的生長[26]。同樣在水稻中OsHAK5受缺鉀和干旱脅迫誘導[27]。馬鈴薯在低鉀脅迫下,多數HAK基因表達量呈上調[28],表明馬鈴薯HAK基因具有低鉀響應特征,可能和低鉀環境下鉀素高效轉運相關。楊樹中多個低鉀高表達基因可能在楊樹低鉀條件下鉀素的高效轉運相關。另外,本研究中使用不同濃度KCl溶液進行鉀元素含量的控制,不能忽略的是隨著K+濃度的改變,Cl-濃度也隨之變化。氯作為植物生長必須的營養元素,Cl-也是細胞維持滲透壓的主要離子,對細胞延長,維持細胞液緩沖體系、水分平衡、提高植物抗旱性具有重要意義[29],而具體Cl-的作用還有待今后深入探討。

本研究在毛果楊全基因組中鑒定出20個KT、HAK、KUP家族成員。隨后對家族成員進行理化性質與亞細胞定位預測分析,構建系統進化樹,開展了順式作用元件分析,最后對4個K+濃度處理楊樹扦插苗的凈生長與組織基因表達進行分析。研究為更好地了解楊樹KT、HAK、KUP基因家族的功能提供了前期基礎,同時也為研究和選育高效鉀吸收的楊樹品種提供了參考信息。