楊樹爛皮病生防菌株X4篩選與鑒定1)

王朝政 張巨濤 劉桐岐 李弘澤 蘇芳葶 周博如

(東北林業大學,哈爾濱,150040)

楊樹(PopulusL.)是我國廣泛栽培的樹種之一。由污黑腐皮殼菌引起的楊樹爛皮病是一種引起樹勢衰弱的重要枝干部病害。目前,該病當下的防治手段以化學防治為主,其他的防治手段有抗病品種的選育,都具有一定的缺點,如抗病品種的培育周期長、成本大、培育出的抗病品種繁育多代后存在抗病退化、抗病能力不高等問題[1]。化學試劑的使用往往伴隨對生態環境平衡的破壞以及污染等問題[2],此外化學藥劑若使用不當會對植物產生損害,直接毒害非靶標生物(包括有害生物的天敵以及有益微生物),同時還有致使病原菌產生抗性等問題。因此,結合我國現實背景以及發展需要,研究生態系統綜合可持續發展的思路勢在必行[3],通過對自然界中天然存在的拮抗細菌的利用來防治爛皮病以維護生態系統平衡的同時高效地抑制有關病害為最終目標。

以芽孢桿菌屬(Bacillussp)菌株作為拮抗菌株是近年來生防菌研究的一大熱點。芽孢桿菌屬菌株普遍擁有對目標病原菌抑制性強、抑菌譜廣的特點。其對于植物內在激素的影響亦能提高植物本身的抗逆性,以多種途徑起到抑制目標病害的作用。貝萊斯芽孢桿菌是廣泛存在于自然界環境中的具有廣泛功能性的一種細菌,在農業、工業甚至生物醫學上都有應用,如作為生防菌抑制水稻稻瘟病菌[4];其含有的多種酶類包括：內切纖維素酶、木質素酶和果膠酶等,而在這些酶種中內切纖維素酶的含量最高,在飼料添加劑、洗滌劑和造紙行業都有應用[5],甚至分解孔雀石[6];其提取物(EPS化合物)具有抗癌能力且對健康的宿主細胞沒有影響[7-8]。近年來,國內外研究表明貝萊斯芽孢桿菌可有效防治花生白絹病、鷹嘴桃腐敗真菌、芋頭干腐病、黃曲霉菌,甚至葡萄球菌及海產品防腐等多種病害和病原菌[9-14]。其生物防治機理已被明確[15]。本研究從黑龍江省尚志市帽兒山實驗林場后山患病楊樹根際土壤處分離出一株拮抗效果良好的細菌X4,并探索X4生理生化特性,初探其對于楊樹爛皮病的防治潛力。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：松球殼孢(Sphaeropsissapinea)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)、交鏈格孢(Alternariaalternata)、希金斯炭疽菌(Colletotrichumhigginsianum)、楊灰星葉點霉(Phyllostictapopulea)和污黑腐皮殼菌(ValsasordidaNit),供試菌均由東北林業大學森林生態系統可持續經營教育部重點實驗室提供;生防菌株為利用稀釋法從東北林業大學實驗林場及帽兒山實驗林場健康及患楊樹爛皮病的病株根圍處得到。

1.2 生防菌的分離純化和篩選

生防菌的分離純化。參考許帥等[16]的方法分離土壤樣品中的芽孢桿菌;利用平板劃線法分離純化出不同形態單菌落,冰箱4 ℃保存備用。

生防菌的篩選。參考張寧等[17]的方法進行生防菌篩選,以污黑腐皮殼菌為靶標菌,使用平板對峙法篩選出對靶標菌具有顯著拮抗效果的細菌。利用下列公式計算抑菌率,篩選對楊樹爛皮病菌具有拮抗效果的生防菌株。

抑菌率=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌塊直徑)]×100%。

1.3 菌株的觀察

生防菌株X4菌落特征。將篩選出的拮抗菌株在牛肉膏蛋白胨培養基上用接種環進行劃線,25 ℃培養72 h,觀察記錄菌落特征并進行革蘭氏染色試驗置于光學顯微鏡下觀察。

楊樹爛皮病菌的掃描電鏡觀察。電鏡樣品的制備及觀察：(1)用打孔器打取帶有目標菌絲的牛肉膏蛋白胨培養基,置于容器中后倒入2.5%戊二醛固定液;(2)用磷酸緩沖液清洗2～4 h重復3次;(3)用1%餓酸處理樣品4～6 h,緩沖液清洗樣品3次,用不同體積分數的乙醇進行梯度脫水各1次,100%乙醇沖洗2次,15～20 min/次,乙酸異戊酯置換2次,每次20 min;(4)室溫干燥,此時樣品制作完成;(5)將樣品黏在貼有導電膠帶的載物臺上噴金后上電鏡觀察。

1.4 生防X4菌株的鑒定及效果測定

生理生化鑒定。使用試劑盒對生防菌菌株進行革蘭氏染色等試驗[18],參照東秀珠和范俐[19-20]的方法進行乙酰甲基甲醇試驗(V-P t測試)及乳糖、檸檬酸鹽、甘油利用試驗,參照夏明聰等[21]的方法進行蛋白酶活性等生化特性的測定。對東北林業大學帽兒山實驗林場楊樹根際土壤篩選出的拮抗細菌菌株的初步鑒定實驗可參照《常見細菌系統鑒定手冊》[19]和《伯杰細菌鑒定手冊》[22]進行。

分子生物學鑒定。參考張寧等[17]的方法進行。利用DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA,用細菌通用引物27-F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492-R(5’-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3’)擴增出菌株的16S rDNA基因序列。將PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,所得的測序結果與NCBI數據庫進行BLAST比對,獲得同源序列,以鄰接法使用Mega 7.0軟件構建系統發育樹。

菌株X4抑菌譜測定。參照1.2中的方法平板對峙法測定菌株X4對其他6種病原菌的抑制作用。

菌株X4生防效果測定。參照喬國彪等[23]和宿靜瑤等[24]的方法,利用燙傷接種法測定菌株在楊樹枝條上對楊樹爛皮病的拮抗活性。選取若干2年生健康楊樹枝條,截成10 cm左右粗細相似的短枝,用2%次氯酸鈉浸泡10 min,75%酒精浸泡1 min,無菌去離子水沖洗3次后晾干。用石蠟將枝條兩端封住以避免營養物質和水分流失。在枝條中間部位用無菌打孔器打孔致出現直徑為6 mm的傷口,將于28 ℃、180 r·min-1培養48 h的X4拮抗菌菌液裝入噴壺并均勻噴施在枝條上,于0.5 h后將楊樹爛皮病菌菌餅貼在傷口上,用無菌脫脂棉包裹并使用保鮮膜封口,定時噴水保持無菌脫脂棉濕潤。本試驗中的陰性對照處理為不接種楊樹爛皮病菌的枝條致傷后噴施LB液體培養基,陽性對照除此之外枝條傷口處還貼楊樹爛皮病菌菌餅,將所有對照組和處理組枝條置于25 ℃恒溫條件和每天16 h光照條件下進行保濕培養。2 d后解開封口膜并揭掉脫脂棉,7 d后測量病斑直徑。

抑菌直徑=接種未拮抗處理組平均菌斑長度-接種拮抗處理組菌斑長度;

拮抗處理組抑菌率=(接種拮抗處理組抑菌直徑/接種未拮抗處理組菌斑長度平均值)×100%;

拮抗處理組平均抑菌率=(接種拮抗處理組平均抑菌直徑/接種未拮抗處理組平均菌斑長度)×100%。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌的分離純化和篩選

通過平板稀釋法從楊樹根際土壤中分離出36株菌株,其中4株對楊樹爛皮病菌抑制效果明顯,分別命名為X4、SX2、X32、SM1(圖1和表1),其中X4對靶標菌抑制效果最好,可達83.96%(圖2),用于后續研究。

表1 生防菌對楊樹爛皮病菌的抑制效果

圖1 4種生防菌株與污黑腐皮殼(Valsasordida Nit)的對峙效果

圖2 顯微鏡下菌株X4對污黑腐皮殼菌的抑制作用

利用光學顯微鏡觀察X4對峙平板菌絲和對照菌落菌絲,發現與生防菌X4對峙的楊樹爛皮病菌絲粗細不均勻,菌絲體生長軌跡彎曲并未得到有效延伸,菌絲互相交織、變粗,部分原生質濃縮顏色變深,且菌絲出現連貫變形(圖2(B)),而對照菌絲粗細均勻,菌絲體生長軌跡呈直線且并未有原生質濃縮及菌絲變粗現象(圖2(A))。

掃描電鏡觀察與生防菌株X4對峙前沿的楊樹爛皮病菌絲,發現處理組菌絲出現變粗、干癟、皺縮、折疊,原生質外溢及菌絲斷裂,而對照菌絲表面光滑,細胞完整,沒有原生質外溢現象(圖3)。

左：正常菌絲;A.斷裂,B.皺縮,C.干癟、折疊、變粗,D.原生質外溢。

2.2 生防菌株X4的鑒定

X4形態學觀察。菌株X4在牛肉膏蛋白胨培養基上生長狀態良好,菌落呈不透明乳白色,培養24 h后菌落呈粗糙不透明,污白色或微黃色;培養48 h后菌體表面出現粗糙皺褶,邊緣不規則,用接種針挑取時呈黏稠狀(圖4A)。顯微鏡觀察菌株呈單細胞橢圓到柱狀,革蘭氏染色呈陽性(圖4B)。在NA培養基上菌體呈短杠狀或梭狀、細胞直徑>1.0 μm,芽孢呈橢圓形。

圖4 菌株X4在牛肉膏蛋白胨培養基上的菌落形態(A)和菌體革蘭氏染色形態(B)

X4生理生化特性。生防菌株X4的生理生化測定結果顯示硝酸還原酶呈陽性、淀粉水解呈陰性、明膠液化呈陽性、甲基紅呈陽性、V-P測定呈陽性、檸檬酸鹽利用呈陰性、丙酸鹽利用呈陰性、蛋白酶活性呈陽性、苯丙氨酸脫氨酶測定呈陰性、吲哚乙酸測定呈陰性、酪氨酸分解測定呈陰性。該菌株在20～40 ℃可穩定生存。

X4菌株的分子生物學鑒定。以細菌基因組DNA為模板,利用16S rDNA基因序列引物經PCR擴增獲得約1 200 bp的目的片段(圖5),測序獲得內生拮抗細菌X4的序列長度為1 176 bp。在NCBI上對測序結果進行BLAST序列分析發現與貝萊斯芽孢桿菌相似,相似率達到99.39%;采用MEGA7軟件中的鄰接法進行系統發育樹構建(圖6),發現其與貝萊斯芽孢桿菌聚為一類。綜合菌落特征、菌體形態,X4菌株生理生化特征、革蘭氏染色反應,16S rDNA鑒定分析,將該菌株鑒定為貝萊斯孢桿菌(Bacillusvelezensis)。

圖5 楊樹根際土壤拮抗細菌X4菌株16S rDNA的PCR分析

圖6 16S rDNA基因序列構建菌株X4系統發育樹

2.3 生防菌株X4抑菌譜測定

由表3可知,平板對峙試驗中菌株X4對其他6種病原菌均表現出良好的抑制效果,抑菌率均在51.00%以上,其中對松球殼孢的抑制作用最強,抑菌率可達75.00%,對交鏈格孢的抑制作用最弱,抑菌率為51.19%(圖7)。

表3 拮抗菌X4活體對供試病原菌的抑菌譜

1.楊灰星葉點霉;2.松球殼孢;3.立枯絲核菌;4.交鏈格孢;5.希金斯炭疽菌;6.腐皮鐮刀菌;CK.對照。

2.4 生防菌株X4防效測定

采用楊樹離體枝條,用燙傷接種法接種污黑腐皮殼菌菌株,測定生防菌株對楊樹爛皮病的防治效果,結果表明：生防菌X4拮抗處理后(圖8中1、2、3序號枝條)較未拮抗處理組(圖8中4、5、6序號枝條)菌斑長度變短、顏色變淺。拮抗后菌斑減少了40.19%以上,平均減少可達46.62%接近50.00%,可見抑制效果十分顯著(表4)。

表4 拮抗菌X4活體對供試病原菌的防治效果

CK為未接種未拮抗對照組;1、2、3為接種拮抗處理組;4、5、6為接種未拮抗處理組。

3 討論與結論

本研究的主要研究對象貝萊斯芽孢桿菌在生物防治中可稱為拮抗微生物[25]或稱生防菌。生物防治措施通過對植物微生物環境的調節,減少病原體的接種量,減少致病性,抑制病害發生,現多用于土傳病害的防治,也用于葉部病害的防治及收后病害的防治。但目前生物防治還存在著生防效果不夠穩定,部分生防菌的適用范圍較窄;此外因為生防菌存在地理適應性較低的問題,其生產、運輸、貯存等條件對生防制劑的要求也比較苛刻,因此比化學防治的防治效益要低,現在也主要作為防治的輔助措施。但在未來隨著科技的發展,這些限制條件將逐一淡去,因此生物防治未來可期。而本研究通過平板對峙試驗篩選出對發生于枝干部的楊樹爛皮病菌具有良好抑制作用的菌株X4即貝萊斯芽孢桿菌也有希望大展身手。

貝萊斯芽孢桿菌所具有的獨特的微生態調控作用,即貝萊斯芽孢桿菌菌株能產生一些次生代謝產物,這些次生代謝產物具有明顯的抗菌抑菌作用并且能夠產生生物膜,具有高效的根部定殖能力,可以有效幫助植物抵御病原微生物的侵染,從而提高植株的抗病性,其已經作為生物肥料和生物防治試劑在農業領域被廣泛應用[26],遺憾的是其作為生防菌的大田防效暫未得到驗證,也并未得到規模化的生產和應用。

但與貝萊斯芽孢桿菌同屬的枯草芽孢桿菌已經在生物防治上有了廣泛的應用[27-28],在全國多個省市縣的水稻、蔬菜和果樹上已經有以枯草芽孢桿菌為主體的微生物殺菌劑的身影存在,與枯草芽孢桿菌相關的殺菌劑與抗病藥劑累計推廣面積超過400萬hm2。增加產值30億元以上。在要求防治效果達到甚至超過70.0%的條件下,其可有效防治水稻、麥類紋枯病、稻曲病、茄科蔬菜枯萎病、果樹輪紋病和黑斑病等多種危害嚴重的病害。在枯草芽孢桿菌的幫助下,我們獲得了更優質的各類農產品,收獲了更高的附加價值。貝萊斯芽孢桿菌有望和枯草芽孢桿菌一樣幫助人們實現經濟社會生態效益的[29]。

本研究以污黑腐皮殼菌為靶標菌從楊樹根際分離出一株細菌X4,可有效抑制污黑腐皮殼菌生長,通過細菌形態學、系統發育分析等將菌株X4鑒定為貝萊斯芽孢桿菌,能有效防治楊樹爛皮病。通過對于被抑制菌絲光學顯微鏡和電子顯微鏡的觀察,發現被抑制菌絲出現膨大、皺縮、萎蔫的現象,初步判斷為細胞膜系統受損導致內容物溢出,這也是未來進一步對于探究有關生防菌劑對于楊樹爛皮病的防治機理的可行方向。經過生防效果測定,該生防菌株對由污黑腐皮殼菌屬引起的楊樹爛皮病有較為良好的防治效果,病斑長度減少40.19%以上,此外該菌株抑菌譜較廣,可抑制除污黑腐皮殼菌外的其他6種植物病原真菌生長,是一種具有廣泛應用前景的生物防治菌株。