長林小蠹腸道可培養細菌群落的組成和結構1)

王美惠 陳煥文 解丹 項嘉建 宇佳 遲德富

(東北林業大學,哈爾濱,150040)

長林小蠹(HylurgusligniperdaFabricius),又名紅毛小蠹,隸屬于鞘翅目(Coleoptera)象鼻蟲科(Curculionidae)林小蠹屬(HylurgusLatreille),原產于歐洲南部及非洲北部的地中海沿岸[1],主要以松屬(Pinus)植物為食。長林小蠹成蟲體長4.0～5.7 mm,入侵能力強[2],很容易通過松樹木材的貿易活動進行傳播,是全球各國在松樹進口木材中截獲最多的昆蟲之一。近百年來,已先后入侵亞洲、大洋洲、南美洲、北美洲、非洲南部的多個國家[3],2019年在我國山東省泰安市首次誘集到長林小蠹,此后,在山東煙臺市也發現了該種的入侵[4]。目前,長林小蠹在我國主要危害黑松(Pinusthunbergia),也可能危害華山松(Pinusarmandii)、赤松(Pinusdensiflora)、油松(Pinustabuliformis)等,長林小蠹已明確在我國定殖并對松屬樹木造成極其嚴重的危害[1]。

腸道微生物在與宿主長期進化的過程中,對宿主的生長發育、營養吸收、免疫調節、解毒代謝等多方面都產生了至關重要的作用;宿主昆蟲則為腸道微生物提供食物以及生存環境,二者協同進化、互惠互利。此外,腸道微生物在綠色防治害蟲方面也具有巨大潛力[5-6]。例如,通過基因改造等手段操縱昆蟲腸道內的共生菌[7],或將優勢菌株開發為害蟲引誘劑等。因此,對于長林小蠹腸道可培養細菌種類的鑒定及種群組成的研究,將有助于探明長林小蠹對寄主的適應機制,為完善長林小蠹的防控體系以及生態控制技術的研發提供科學依據。近年來,對昆蟲腸道微生物的研究日益深入,研究表明,昆蟲腸道內存在多種多樣的微生物,多數昆蟲腸道的微生物中,細菌豐度最高,約占90%以上[8],是昆蟲腸道微生物的優勢菌群。在細菌分類中,昆蟲腸道內大部分細菌屬于變形菌門。在國外,對長林小蠹伴生真菌的研究居多[9-10],但到目前為止,對其耐受和降解植物防御物質相關的腸道細菌群落了解甚少;在國內,由于長林小蠹定殖中國不久,對該種腸道細菌的研究報道較少,但對于目前我國分布的其他小蠹蟲腸道細菌的研究已有一些文獻報道。婁哲巧[11]采用傳統的微生物培養方法研究了紅脂大小蠹(Dendroctonusvalens)成蟲和幼蟲腸道、蛹的體表及坑道蛀屑可培養細菌的多樣性,共同分離得到59種細菌,其中變形菌門的沙雷氏菌屬(Serratia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和Rahnella屬為優勢均屬。胡霞[12]采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)及基因克隆轉化的方法研究了華山松大小蠹(Dendroctonusarmandi)成蟲、幼蟲和蛹的腸道細菌多樣性,發現10個細菌屬,其中變形菌門的檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)和泛菌屬(Pantoea)為優勢均屬。本研究以采集自山東省煙臺市牟平區的長林小蠹為樣本,通過傳統培養結合形態學及16S rDNA測序對長林小蠹腸道優勢可培養細菌進行了初步分離鑒定,為進一步探討長林小蠹腸道微生物的功能及其生物防治方法奠定基礎。

1 材料與方法

供試蟲源：采集時間為2022年5月,從位于山東省煙臺市牟平區的黑松林場內采集長林小蠹的成蟲和幼蟲,采集方法為尋找有長林小蠹鉆蛀孔的黑松伐樁,將地面上方樹干的樹皮剝開,沿著坑道可以找到長林小蠹的成蟲和幼蟲,用鑷子小心夾出并放入已打孔且放有從野外收集的黑松韌皮碎屑的塑料盒中帶回實驗基地。長林小蠹在實驗基地內的飼養條件為恒溫25 ℃,相對濕度70%,無光照。試驗時選擇大小一致、健康活躍的昆蟲供試。

LB培養基：胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化鈉10 g,瓊脂粉15～20 g,無菌水1 000 mL,pH=7.0[13]。

NA培養基：牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,氯化鈉5 g,瓊脂15～25 g,無菌水1 000 mL,pH=7.4～7.6[13]。

厭氧菌瓊脂培養基：厭氧菌瓊脂(青島高科技工業園海博生物技術有限公司)58.4 g,無菌水1 000 mL[14]。

1.1 長林小蠹腸道細菌的分離與培養

隨機選取30頭健康的長林小蠹成蟲與30頭發育程度相同的幼蟲,饑餓處理24 h后,在無菌環境下進行解剖。用無菌水沖洗成蟲和幼蟲的體表,再用體積分數75%的酒精對蟲體體表消毒2 min,最后用無菌水漂洗蟲體30 s。在放有5 mL PBS緩沖液的滅菌培養皿中進行解剖,將解剖出的成蟲和幼蟲腸道分別放在含有1 mL PBS緩沖液的1.5 mL離心管中,用研磨棒徹底研磨至勻漿,用無菌水迅速稀釋至研磨液體積分數為10-1～10-44個梯度。采用LB、NA和厭氧菌瓊脂3種培養基進行細菌培養。將10-2、10-3、10-43個體積分數進行3種平板稀釋涂布,每個梯度涂3個平板,每塊平板涂20 μL的勻漿液,兼性厭氧菌的培養放于有厭氧產氣袋的厭氧罐中[15],培養箱中25 ℃培養72 h后,挑選出菌落數在 30～300的培養基,用接種環挑取不同生長性狀的單菌落進行純化培養,每個平板至少純化5次得到純菌株,純化后的菌株用液體培養基培養后,加入最終體積分數為30%的甘油于-80 ℃進行保存備用,試驗重復3次。

1.2 長林小蠹腸道細菌的形態觀察

將分離純化后得到的細菌菌株采用平板劃線法接種于新的LB平板上,在25 ℃下培養24～36 h,待菌落長成后,對菌落進行革蘭氏染色[13],并觀察菌株的形態,依據《常見細菌系統鑒定手冊》的方法對其特征進行描述和鑒定[16]。

1.3 細菌菌株的DNA提取及PCR擴增

本研究采用凍融法提取各細菌基因組的DNA[17],具體操作如下：將純化后的菌株接種于LB液體培養基中,25 ℃、150 r/min 振蕩培養24 h后至菌液渾濁,兼性厭氧菌單菌落接種于厭氧菌肉湯培養基(山東拓普生物工程有限公司)后置于有厭氧產氣袋的厭氧罐中,25 ℃靜置培養24 h后至菌液渾濁。每個菌株分別取1 mL菌液于1.5 mL離心管中,12 000 r/min 離心1 min,棄上清液,重復上述操作兩次,向離心管中加入500 μL的無菌雙蒸水,液氮冷凍10 min后,置于水浴鍋99 ℃ 20 min,取出后12 000 r/min離心2 min,以上清液作為模板。以細菌16S rDNA通用引物27 F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3’)和1492 R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)進行PCR擴增。

PCR反應體系25.0 μL：上、下游引物各1.0 μL、DNA模板1.0 μL、PCR Mix 12.5 μL、dd H2O 9.5 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 1 min, 56 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,進行30個循環;72 ℃延伸10 min。

取5.0 μL PCR產物用于1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,檢測后將PCR產物送至睿博興科(東北)測序部進行測序。

1.4 腸道細菌的系統發育樹構建

將測序結果與GenBank數據庫中的序列進行BLAST同源性比對,一般認為序列的相似率>99%為同種, 95%～99%為同屬, <95%為同科。選取并下載與菌株同源性最高的序列作為比對菌株的序列,與測序獲得的細菌序列一起,運用MEGA11.0軟件和國際通用的Neighbor-Joining構建系統發育進化樹,用Bootstrap法計算1 000次進行檢測,以此判定其分類學地位。

2 結果與分析

2.1 長林小蠹腸道可培養細菌的形態特征

從長林小蠹腸道中共分離獲得20株形態、顏色和大小各異的細菌菌株。菌落形態多為圓形,僅有1株為不規則狀;從顏色看,有白色、乳白色、淺白色、乳白偏黃、淡黃色;從細菌形態看,有2株為球狀,18株為桿狀;革蘭氏染色結果表明,有3株菌呈陽性,17株菌呈陰性。詳細培養性狀見表1。

表1 長林小蠹腸道細菌的菌落形態及培養性狀

2.2 長林小蠹腸道細菌的16S rDNA序列分析結果

長林小蠹腸道細菌菌株測序后與NCBI數據庫比對,分離到的腸道細菌與相應菌株的16S rDNA序列相似度均在98%～100%。從表2看,這20株細菌隸屬于2門4綱6目9科15屬18種,初步鑒定得到：解蛋白芽孢桿菌(Bacillusproteolyticus)1株,乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)1株,布魯氏菌(Brucellapseudintermedia)1株,熱帶副伯克霍爾德菌(Paraburkholderiatropica)1株,洋蔥伯克氏菌(Burkholderiastagnalis)1株,Pantoeacypripedii1株,成團泛菌(Pantoeaagglomerans)1株,野梧桐歐文氏菌(Erwiniamallotivora)1株,Erwiniaendophytica1株,黏質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)1株,蛋白原假單胞菌(Pseudomonasprotegens)2株,羅克西拉席爾瓦菌(Rouxiellasylvae)1株,科薩克尼亞嗜米腸桿菌(Kosakoniaoryziphila)1株,產氣克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes)1株,催產克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)1株,土生拉烏爾菌(Raoultellaterrigena)1株,Raoultellaelectrica1株,赫爾曼亞特蘭大桿菌(Atlantibacterhermannii)1株,耐冷哈夫尼菌(Hafniapsychrotoler)2株。

表2 長林小蠹腸道細菌的16S rDNA序列比對

2.3 系統發育樹分析結果

圖1顯示,長林小蠹腸道可培養細菌的系統發育樹分為2大枝18小枝,兩大枝分別為厚壁菌門和變形菌門,其中厚壁菌門芽孢桿菌屬的菌株A01與它的模式菌株Bacillusproteolyticus聚為一類,乳球菌屬的菌株A02與它的模式菌株Lactococcuslactis聚為一類,這2小枝又聚在一起合成一大枝,表明這2種細菌的親緣關系較近;變形菌門布魯菌屬的A03與它的模式菌株Brucellapseudintermedia單獨聚為一類;變形菌門帕拉伯克霍爾德氏菌屬的菌株A04與它的模式菌株Paraburkholderiatropica聚為一類,伯克霍爾德屬的菌株A05與它的模式菌株Burkholderiastagnalis聚為一類,這2小枝又聚在一起合成一大枝,表明這兩種細菌的親緣關系較近;變形菌門假單胞菌屬的A19和A20與它的模式菌株Pseudomonasprotegens單獨聚為一類;歐文氏菌屬的菌株A08與它的模式菌株Erwiniamallotivora聚為一類;泛菌屬的菌株A06與它的模式菌株Pantoeacypripedii聚為一類,歐文氏菌屬的菌株A09與它的模式菌株Erwiniatypographi聚為一類,這2小枝又聚在一起合成一大枝,表明這2種細菌的親緣關系較近;Atlantibacter屬的菌株A16與它的模式菌株Atlantibacterhermannii聚為一類;科薩克氏菌屬的A12與它的模式菌株Kosakoniaoryziphila聚為一類,這2小枝又聚在一起合成一大枝,表明這2種細菌的親緣關系較近;泛菌屬的菌株A07與它的模式菌株Pantoeaagglomerans聚為一類;拉烏爾菌屬的菌株A14與它的模式菌株Raoultellaterrigena聚為一類,菌株A15與它的模式菌株Raoultellaelectrica聚為一類,克雷伯氏菌屬的菌株A13與它的模式菌株Klebsiellaoxytoca聚為一類,這3小枝又聚在一起合成一大枝,表明這3種細菌的親緣關系較近;沙雷氏菌屬的菌株A10與它的模式菌株Serratiamarcescens聚為一類,哈夫尼亞菌屬的A17和A18與它的模式菌株Hafniapsychrotolerans聚為一類,Rouxiella屬的菌株A11與它的模式菌株Rouxiellasilvae聚為類,這3小枝又聚在一起合成一大枝,表明這3種細菌的親緣關系較近。

圖1 16S rDNA 序列構建的長林小蠹腸道細菌系統發育樹(鄰接法)

2.4 長林小蠹成蟲和幼蟲腸道可培養細菌屬種組成

從屬的水平上看,長林小蠹成蟲腸道中可培養的細菌有10個屬,分別為芽孢桿菌屬、乳球菌屬、泛菌屬、歐文氏菌屬、沙雷氏菌屬、Rouxiella屬、科薩克氏菌屬、克雷伯氏菌屬、拉烏爾菌屬、哈夫尼亞菌屬。其中,沙雷氏菌屬、Rouxiella屬和科薩克氏菌屬的細菌相對分離率為 32.3%、16.1%和13.9%,均是成蟲腸道分離菌株中的優勢菌屬。幼蟲腸道中可培養的細菌有15個屬,分別為芽孢桿菌屬、乳球菌屬、布魯菌屬、帕拉伯克霍爾德氏菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、泛菌屬、歐文氏菌屬、沙雷氏菌屬、Rouxiella屬、科薩克氏菌屬、克雷伯氏菌屬、拉烏爾菌屬、Atlantibacter屬、哈夫尼亞菌屬、假單胞菌屬。其中,歐文氏菌屬、沙雷氏菌屬、克雷伯氏菌屬和Rouxiella屬的細菌相對分離率為17.6%、23.1%、13.2%和13.2% ,均是幼蟲腸道分離菌株中的優勢菌屬(表3)。

表3 長林小蠹成蟲與幼蟲腸道可培養細菌在屬水平上的組成情況

從種水平上看,長林小蠹成蟲腸道中可培養的細菌有 10 種,分別為解蛋白芽孢桿菌、乳酸乳球菌、Pantoeacypripedii、野梧桐歐文氏菌、黏質沙雷氏菌、羅克西拉席爾瓦菌、科薩克尼亞嗜米腸桿菌、催產克雷伯菌、土生拉烏爾菌、耐冷哈夫尼菌。其中,黏質沙雷氏菌、羅克西拉席爾瓦菌和科薩克尼亞嗜米腸桿菌的相對分離率為32.3%、16.1%和13.9%,是成蟲腸道分離菌株中的優勢菌種。長林小蠹幼蟲腸道中可培養的細菌有 18 種,分別為解蛋白芽孢桿菌、乳酸乳球菌、假中間布魯氏菌、熱帶副伯克霍爾德菌、洋蔥伯克氏菌、Pantoeacypripedii、成團泛菌、野梧桐歐文氏菌、Erwiniatypographi、黏質沙雷氏菌、羅克西拉席爾瓦菌、科薩克尼亞嗜米腸桿菌、催產克雷伯菌、土生拉烏爾菌、Raoultellaelectrica、赫爾曼亞特蘭大桿菌、耐冷哈夫尼菌、蛋白原假單胞菌。其中,黏質沙雷氏菌、野梧桐歐文氏菌、羅克西拉席爾瓦菌和催產克雷伯菌的相對分離率為23.1%、16.5%、13.2%和13.2%,是幼蟲腸道分離菌株中的優勢菌種(表4)。

表4 長林小蠹成蟲與幼蟲腸道可培養細菌在種水平上的組成情況

3 結論與討論

昆蟲腸道內棲息著大量的微生物,在長期協同進化的過程中與寄主發展為密不可分的共生關系,協助寄主適應各種生境[18]。本研究采用傳統細菌分離培養法結合形態學及16S rDNA測序技術,對采自山東省煙臺市牟平區以黑松為寄主的長林小蠹成蟲及幼蟲的腸道細菌進行分離培養,共分離到2門4綱6目9科15屬18種。從門水平看,成蟲和幼蟲腸道可培養細菌均以變形菌門為優勢菌門,厚壁菌門少量存在,符合昆蟲腸道細菌優勢菌門的研究結果[19];從科水平看,γ-變形菌綱中的腸桿菌科和歐文氏菌科是優勢菌科,與婁巧哲[11]對紅脂大小蠹腸道可培養細菌的優勢菌科一致;從屬水平上看,長林小蠹腸道可培養細菌一共有15個屬,分別為芽孢桿菌屬、乳球菌屬、布魯菌屬、帕拉伯克霍爾德氏菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、泛菌屬、歐文氏菌屬、沙雷氏菌屬、Rouxiella屬、科薩克氏菌屬、克雷伯氏菌屬、拉烏爾菌屬、Atlantibacter屬、哈夫尼亞菌屬、假單胞菌屬;其中,成蟲腸道細菌優勢菌屬為沙雷氏菌屬、Rouxiella屬及科薩科氏菌屬,幼蟲腸道細菌優勢菌屬為沙雷氏菌屬、歐文氏菌屬、Rouxiella屬及克雷伯氏菌屬,與婁巧哲對紅脂大小蠹腸道可培養細菌及胡霞對華松山大小蠹腸道細菌多樣性分析的研究報道具有一定的相似性[11-12]。與目前我國分布的其他小蠹蟲相比,布魯氏菌屬和Atlantibacter屬是長林小蠹腸道可培養細菌所特有的屬,假中間布魯氏菌(Brucellapseudintermedia)和赫爾曼亞特蘭大桿菌(Atlantibacterhermannii)是長林小蠹腸道可培養細菌所特有的種。

沙雷氏菌屬和Rouxiella屬作為長林小蠹腸道可培養細菌的優勢菌屬,在成蟲和幼蟲腸道內均處于優勢地位。據報道,沙雷氏菌屬的細菌通過在寄主腸道中形成免疫反應等方式,如誘導細胞色素P450和谷胱甘肽S-轉移酶等解毒酶對萜烯化合物進行降解[20-21],由此推測沙雷氏菌屬的細菌提高了長林小蠹對新環境的入侵和適應能力;對于Rouxiella屬的細菌報道較少,有研究從樹液分泌物中分離出Rouxiella屬的細菌[22],推測可能通過長林小蠹的取食和蛀道等行為進入腸道,其功能還需進一步探討。歐文氏菌屬和克雷伯氏菌屬作為長林小蠹幼蟲腸道可培養細菌的優勢菌屬,通過產生分解酶的方式降解纖維素[23],協助幼蟲的食物消化和營養利用。此外,本研究還發現,幼蟲與成蟲腸道細菌存在一定的差異,幼蟲腸道中存在的布魯菌屬、帕拉伯克霍爾德氏菌屬以及Atlantibacter屬等,猜測可能與幼蟲生長發育的特定需求有關[24],也可能參松屬植物防御物質的解毒作用,如代謝萜類化合物及酚類化合物等[25-26]。以上細菌對于長林小蠹生理生化過程的影響,還有待進一步挖掘。

長林小蠹是全球林業重要的害蟲,尤其是對松科植物的危害極其嚴重,對其腸道細菌進行研究,不僅可以補充昆蟲腸道共生菌的資源庫,還可以據此進一步分析腸道細菌對昆蟲生長發育、營養調控以及解毒代謝的影響,最終得到綠色防治長林小蠹的生物制劑,從而降低其危害。