基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD信號通路探討針灸預防應激性胃潰瘍細胞焦亡的作用機制

蘭永利 霍新慧 李 盼 韋 芳 阿力米熱·阿布都熱西提

（新疆醫科大學中醫學院，新疆烏魯木齊 830054）

應激性胃潰瘍（stress-induced gastric ulcers，SGU）被認為是一種與應激相關的黏膜損傷，一般是由胃黏膜缺血、血液灌注不足或再灌注損傷應激所引起的[1]。引起SGU發生發展的因素有很多，由酒精刺激胃黏膜導致黏膜應激反應，從而使黏膜自身防御下降引起缺血、灌注不足是SGU發生的主要原因之一。而胃黏膜組織的正常生理功能關系著人們飲食生活的正常進行，胃黏膜的病變損傷，會引起人們飲食方式和營養攝入的改變，從而導致健康水平下降。因此，提高胃黏膜自身保護防御能力，預防SGU的發生發展成為當前的研究熱點。本課題組前期研究發現，針灸預處理可通過調控炎癥反應通路、氧化應激等預防應激性胃潰瘍[2]。而近來有研究得出結論，一種促炎性、程序性細胞的死亡形式是細胞焦亡[3]，細胞焦亡的經典通路在胃黏膜損傷過程中發揮著重要作用，隨著應激強度的增加，胃黏膜上皮細胞的增殖減少、焦亡增多，加重胃黏膜損傷。NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）/消皮素D（GSDMD）是細胞焦亡經典通路，以NLRP3炎癥小體形成、Caspase-1激活、GSDMD切割為特征[4]。

在治療已經發生的胃黏膜損傷方面，西醫治療手段療效已經得到了廣泛的認可，但其在預防方面并不具備優勢。“治未病”是中醫特色，有研究證明，針灸在“治未病”方面發揮著較好的作用[5]，但目前尚未有研究基于細胞焦亡通路探索針刺與艾灸預防SGU的作用機制。本研究觀察針刺與艾灸預處理對SGU的預防作用及其對細胞焦亡經典通路NLRP3/Caspase-1/GSDMD的干預作用，探討針刺與艾灸預防應激性胃潰瘍的作用機制，為針灸進一步應用于臨床預防SGU提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠52只，雌雄各半，體質量（180±20）g，購自新疆醫科大學動物實驗中心，動物合格證號：SYXK（新）2018-0003。大鼠自由攝食、攝水，飼養室溫度：20～25℃，相對濕度：50%～54%，自然晝夜交替。在實驗開始前適應性飼養7 d。實驗過程符合新疆醫科大學動物實驗中心倫理學標準（倫理批號：IACUC-20230227-3）。

1.2 藥物與試劑 無水乙醇，購自天津市凱通化學試劑有限公司；阿司匹林腸溶片（拜耳醫藥有限公司，國藥準字：J20130078），研磨成粉狀后，與生理鹽水按照2000 mg∶100 mL配置成阿司匹林混懸液；酶聯免疫吸附（ELISA）法腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-18試劑盒（批號：YX-E21174、YX-E20958、YX-E21122、YX-E21189），購自上海優選生物科技有限公司；Invent總蛋白提取試劑盒（批號：SD001/SN002），購自美國Invent公司；SDS-PAGE分離膠制備試劑盒（批號：BP112）、SDS-PAGE濃縮膠制備試劑盒（批號：BP108）、BCA蛋白含量檢測試劑盒（批號：BP104）、預染蛋白分子量標準（批號：BP117）、蛋白質免疫印跡（Western blot）法專用型轉印濾紙（批號：BP202），購自中國Bio-Platform公司；ECL檢測試劑盒（批號：34580），購自美國Thermo公司。

1.3 主要儀器 一次性針灸針（華佗牌，規格0.25 mm×13 mm），購自蘇州醫療用品廠有限公司；艾灸條（規格4 mm×120 mm），購自南陽漢醫艾絨有限公司；大鼠固定支架，購自蘄春上工記艾灸器具開發有限公司；酶標分析儀（型號：Infinite F50），購自上海優選生物科技有限公司；蛋白印跡儀（型號：Yrdimes SW07D0567）、KETA M多用凝膠成像系統，購自臺灣威泰克有限公司；臺式恒溫振蕩器（型號：THZ-312），購自上海精宏實驗設備有限公司。

2 實驗方法

2.1 分組與預處理 采用數字編號法對52只SD大鼠進行標號，而后按照隨機數字法將其分為4組，分別為正常組、模型組、預灸組、預針刺組，每組13只。適應性飼養7 d后，于每日上午10∶00開始進行干預操作。正常組與模型組：支架固定，不做其他處理，20 min/次，1次/d，連續7 d；預灸組：支架固定，溫和灸懸灸中脘、足三里（雙），20 min/次，1次/d，連續7 d；預針刺組：支架固定，針刺中脘、足三里（雙），平補平瀉，留針20 min，1次/d，連續7 d。每次干預操作結束后，解除大鼠支架固定，回飼養室進行正常喂養。大鼠中脘和足三里取穴參照《實驗動物常用穴位名稱與定位第2部分：大鼠》[6]確定穴位位置，中脘穴位于臍上約20 mm處，足三里穴位于膝關節后外側，在腓骨小頭下約3 mm處。

2.2 造模 末次干預處理結束后，禁食不禁水1 d，次日開始對模型組、預灸組、預針刺組大鼠進行SGU模型的制備。采用無水乙醇與阿司匹林混懸液灌胃法建立大鼠SGU模型，先予無水乙醇0.6 mL/100 g灌胃，1 h后再予阿司匹林混懸液200 mg/kg灌胃，每日無水乙醇與阿司匹林混懸液各灌胃1次，連續4 d。正常組大鼠常規飼養，不作處理。本研究所用造模方法已經課題組前期實驗證實，方法可靠，造模成功率高[7]。

2.3 取材 造模結束后當日22∶00開始禁食禁水，次日上午10∶00開始取材。各組大鼠采用10%水合氯醛麻醉；腹主動脈取血，離心半徑10 cm、3000 r/min離心20 min，收集上清液，-80 ℃冰箱中儲存待測；取出全胃，沿胃大彎剪開，用生理鹽水沖洗干凈，充分暴露胃黏膜組織，觀察并拍照；將每只大鼠胃組織分成兩部分，一部分于4%多聚甲醛中固定，另一部分儲存于-80 ℃液氮中。

2.4 指標檢測

2.4.1 評定胃黏膜損傷指數（UI） 采用GUTH P H等[8]的方法評定UI。將沖洗干凈的胃黏膜組織平鋪于濾紙上，于10倍放大鏡下肉眼觀察，卡尺測量評估損傷程度：1分，損傷（包括糜爛點）長度小于1 mm；2分，損傷長度介于1～2 mm；3分，損傷長度介于2～3 mm；4分，損傷長度介于3～4 mm；5分，損傷長度大于4 mm；若損傷處寬度大于2 mm，則計分加倍。每只大鼠UI評分為胃黏膜各處損傷計分值之和。

2.4.2 蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察胃黏膜組織病理 取應用4 %多聚甲醛溶液固定的各組大鼠胃組織，經脫水、石蠟包埋等常規操作，選取胃黏膜糜爛程度最明顯處切厚度為5 μm的薄片，脫蠟脫水、HE染色，于400倍光學顯微鏡下觀察胃黏膜組織的病理形態。

2.4.3 ELISA法檢測各組大鼠血清炎癥因子水平 取各組大鼠血清，嚴格遵照ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平。

2.4.4 Western blot法檢測NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達 取液氮凍存的每組3只大鼠100 mg胃黏膜組織，在培養皿中剪碎成3 mm×3 mm左右的小塊，使用0.5～1 mL冷RIPA裂解液勻漿，充分裂解后，離心20 min（4 ℃，離心半徑10 cm，10 000 r/min）取上清液，蛋白濃度采用BCA法測定。進行電泳、轉膜、封閉，加入對應的NLRP3（1∶50）、Caspase-1（1∶50）、GSDMD（1∶50）一抗，4 ℃孵育過夜，用5%脫脂奶粉封閉液稀釋二抗（1∶8000），室溫搖床振蕩反應1～2 h，洗膜10 min×3次后，ECL發光法顯色。使用Gel-Pro Analyzer4軟件對結果進行灰度分析。

2.5 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件對數據進行統計學分析，數據均進行正態性和方差齊性檢驗。本研究所有數據均符合或近似正態分布，采用均值±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊用LSD法分析，方差不齊用Dunnett's T3法分析，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠胃黏膜形態及UI值比較 正常組大鼠胃黏膜組織表面光滑；模型組大鼠胃黏膜組織表面出現顯著出血灶，UI值明顯高于正常組（P＜0.01）；預灸組和預針刺組大鼠胃黏膜組織表面只有少量出血灶，UI值明顯低于模型組（P＜0.01），提示艾灸或針刺預處理對預防胃黏膜損傷有效；與預針刺組相比，預灸組大鼠胃黏膜組織表面出血灶更少，UI值也更低（P＜0.05），提示艾灸預處理對SGU的預防效果優于針刺預處理。詳見圖1、表1。

表1 各組大鼠胃黏膜UI值比較 單位：分

圖1 各組大鼠胃黏膜形態

3.2 各組大鼠胃黏膜組織病理形態比較 正常組大鼠胃黏膜組織未見病理改變，無紅細胞滲出；模型組大鼠出現嚴重的胃黏膜損傷，有大量紅細胞滲出；預灸組和預針刺組大鼠胃黏膜組織基本正常，見少量紅細胞滲出。詳見圖2。

圖2 各組大鼠胃黏膜組織病理學形態（HE，×400）

3.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平比較 模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平均明顯高于正常組（P＜0.01）；預灸組和預針刺組大鼠上述炎癥因子水平均明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）；預灸組大鼠上述炎癥因子水平均明顯低于預針刺組（P＜0.05，P＜0.01）。詳見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平比較（） 單位：pg/mL

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平比較（） 單位：pg/mL

注： 與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與預針刺組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別動物數/只TNF-αIL-1βIL-6IL-18正常組13148.33±12.14 64.03±14.2287.33±14.58108.45±13.22模型組13311.12±11.28**137.18±9.11**202.90±16.17**214.60±13.42**預灸組13202.59±21.35##△△ 91.53±10.37##△ 124.43±12.29##△△141.48±16.17##△△預針刺組13267.84±25.32#106.76±9.89##174.81±16.56##186.12±14.48##

3.4 各組大鼠胃黏膜組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達比較 模型組大鼠胃黏膜組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達水平明顯高于正常組（P＜0.05）；預灸組和預針刺組大鼠胃黏膜組織上述蛋白表達均明顯低于模型組（P＜0.05）；預灸組大鼠胃黏膜組織Caspase-1蛋白表達水平明顯低于預針刺組（P＜0.05）。詳見表3、圖3。

表3 各組大鼠胃黏膜組織NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白表達水平比較（）

表3 各組大鼠胃黏膜組織NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白表達水平比較（）

注： 與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與預針刺組比較，△P＜0.05。

組別動物數/只NLRP3Caspase-1GSDMD正常組30.208±0.0010.193±0.0010.191±0.000模型組30.802±0.000*0.951±0.002*1.358±0.340*預灸組30.537±0.003#0.302±0.003#△0.242±0.011#預針刺組30.449±0.021#0.429±0.002#0.417±0.015#

圖3 各組大鼠胃黏膜組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白電泳圖

4 討論

胃黏膜組織的完整性對于胃維持正常的生理功能十分重要，胃黏膜在正常的生理條件下，依托自身完整的結構來進行防御和修復[9]。然而，近年來人們對自身胃組織的保護意識逐漸淡漠，導致胃黏膜的自我修復和防御機能下降，引發炎性反應，導致應激性胃潰瘍的發病率越來越高[10]。

本研究采用無水乙醇聯合阿司匹林混懸液灌胃的方法建立應激性胃潰瘍模型，其中無水乙醇可引起胃黏膜上皮細胞變性壞死[11]，阿司匹林會使環氧合酶的活性降低，使胃黏膜黏液、血流量降低，防御力下降[12]，從而導致胃黏膜急性損傷，進而引起應激性胃潰瘍。使用兩種藥物造模相較于單一藥物造模對胃黏膜組織的刺激性更大，從而可以減少造模時間和提高成功率。本研究結果表明，模型組大鼠UI值明顯高于正常組，出現嚴重的胃黏膜損傷，有大量紅細胞滲出，表明SGU模型制備成功。

中醫學未病先防理念與現代醫學所認為的提前激發胃黏膜自身防御和修復機制理念不謀而合，而針灸可通過激發人體正氣，減少胃黏膜的損傷[13]。有研究表明，針灸治療胃黏膜損傷有獨特的優勢[14]。尤其是灸法，以溫熱之力刺激來調節自身免疫代謝，應用灸法可使胃黏膜的自我保護得到激發，使黏液達到最佳水平，修復和保護胃黏膜，來達到避免胃黏膜損傷的目的[15-16]。

作為足陽明胃經合穴的足三里，在《針灸大成》中治療脾胃系統疾病時出現的頻率最高[17]，《四總穴歌》中的“肚腹三里留”也證實了足三里對于治療脾胃病的獨特療效。現代研究發現，針刺足三里能促進胃腸蠕動，提高胃血流量，保護胃黏膜[18]，且足三里作為保健要穴，常灸足三里可以提高機體自我防御能力。中脘為胃之募穴，是胃氣所聚之處，文獻顯示，電針足三里、中脘對于改善胃黏膜損傷有顯著療效[19]。

細胞焦亡是一種伴隨著炎癥反應的新型細胞程序性死亡[20]。在NLRP3/Caspase-1/GSDMD經典焦亡通路中，NLRP3是炎癥反應的核心[21]，會通過作用形成NLRP3炎癥小體，最終使Caspase-1活化。活化后的Caspase-1使無活性的炎癥因子前體成熟和分泌，切割GSDMD的N端序列，使其結合到膜上產生膜孔，引起細胞的滲透性腫脹、質膜破裂以及IL-1β和IL-6等炎癥因子大量釋放，使炎癥反應擴大[22]。有研究證明，NLRP3、Caspase-1、GSDMD等蛋白大量表達是細胞焦亡的重要標志[23]。TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18為炎癥因子，炎癥因子的大量釋放，會促使炎癥反應發生，進而引起胃黏膜的損傷。本研究結果表明，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平，胃黏膜組織NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表達水平均明顯高于正常組，而預灸組和預針刺組大鼠上述指標均明顯低于模型組，其中預灸組在改善血清炎癥因子、降低Caspase-1蛋白表達水平方面更具優勢。結果說明艾灸、針刺預處理可能通過抑制NLRP3蛋白的表達，從而降低NLRP3炎性小體合成，進而抑制焦亡標志蛋白的形成，減少炎性反應發生，使胃黏膜防御和自我修復力增強，而艾灸預防胃黏膜損傷的效果優于針刺。

綜上，針刺和艾灸都可以預防應激性胃潰瘍，提高胃黏膜自我修復和防御，減輕胃黏膜損傷程度，其可能的作用機制是對NLRP-3/Caspase-1/GSDMD細胞焦亡經典通路的調控。本課題組猜測，艾灸因其以溫熱之力刺激，刺激作用持久、滲透力強，因此作用效果優于針刺，但具體情況還有待進一步研究。下一步課題組擬對焦亡蛋白進行研究，更加深入地探討細胞焦亡通路在應激性胃潰瘍中的具體效應機制，為艾灸、針刺預處理的作用效果對比尋求充分的實驗基礎。