一株C型產氣莢膜梭菌的分離與鑒定

宋鋒，劉賽，榮榕

（山東省濱州市博興縣畜牧獸醫服務中心 山東濱州 256600）

產氣莢膜梭菌（魏氏梭菌）是一種革蘭氏陽性、桿狀、可形成芽孢的厭氧菌，產氣莢膜梭菌是一種人畜共患病原菌、其特點是在體內或者食物中生長迅速，菌體細胞數量在10 min 內可以翻倍[1]，該菌在生長過程中快速產生有毒氣體（如亞硫酸鹽），可引起人畜各種組織感染，如污染傷口的氣性壞疽，人類胃腸炎（包括食源性和非食源性腹瀉），動物的壞死性腸炎（NE），牛、羊和家兔的梭菌病等[2-3]。另外，產氣莢膜梭菌是食品加工衛生方面的重要指標，其在周圍環境中廣泛分布，經常從土壤及動物腸道和糞便中分離出來[4]。其在不適宜生存的惡劣條件下（如缺乏營養、干燥、高溫、低溫、紫外照射等）可以形成對外界具有較強抗性的芽孢，芽孢作為其生物休眠體具有很強的生存能力，不易被常規消毒劑、高溫高壓等滅菌條件所殺滅，在環境適宜時，芽孢桿菌可以重新萌發繁殖，具有很強的致病性，往往給畜牧養殖業（豬、牛、羊及家禽等）帶來巨大的經濟損失[5-6]。近年來產氣莢膜梭菌耐藥性隨著抗菌藥物的大量使用逐年增加，許多臨床強毒株出現了多重耐藥性，給養殖業健康發展和食品安全、人類健康帶來了巨大的挑戰[7]。

羊梭菌病是由產氣莢膜梭菌引起的一種急性、高度致死性疾病，常包括羊快疫、猝狙、腸毒血癥、羔羊痢疾、黑疫等，每年因該病對養羊業造成巨大的損失[8-9]。該菌感染羊只后可出現食欲減退、反芻次數減少，進而出現腹脹、腹瀉、呼吸困難甚至突然死亡等臨床癥狀，發病羊只剖檢變化為心臟、腎臟、肺臟、胃、腸道等多器官水腫、出血等剖檢變化。膘情較好的羊只感染產氣莢膜梭菌后可出現急性死亡癥狀，往往沒有得到救治的機會，發病動物的病死率30%以上[10]。

本文從山東博興縣某羊場的一只疑似梭菌病患病羊肝臟進行細菌分離，通過對分離菌菌落特征分析、革蘭氏染色鏡檢及產氣莢膜梭菌α（CPA）、β（CPB）、ε（ETX）和ι（ITX）四種毒素進行PCR 鑒定，確定該分離菌為羊源C 型產氣莢膜梭菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1）病料。山東博興縣某羊場中疑似梭菌病患病羊。

2）試劑及儀器。綿羊血平皿及卵黃瓊脂基礎培養基、藥敏紙片為杭州微生物試劑有限公司產品、革蘭氏染色試劑從青島海博生物技術有限公司購買；PCR Mix 為北京百泰克生物技術有限公司產品，DL2000 為AG 公司產品；厭氧培養箱為上海新苗儀器設備制造有限公司設備、細菌基因組提取試劑盒及PCR 擴增試劑購自濟南盛偉生物科技有限公司。

1.2 方法

1）細菌的分離培養。取病羊肝臟放于無菌玻璃平皿中，對肝臟表面進行消毒處理、使用無菌手術刀，切開肝臟，使用一次性接種環蘸取肝臟內部病料，劃線接種于綿羊血平皿中，將平皿置于42 ℃厭氧培養箱中進行分離培養。

2）細菌表面形態觀察。經42 ℃培養24 h 后，將平板取出，觀察細菌菌落形態，將分離菌劃線卵黃瓊脂板上進行厭氧培養后取單菌落進行革蘭氏染色鏡檢。

3）分離菌的PCR 分型鑒定：①細菌基因組的提取。用滅菌的接種環挑取單菌落接種于魏氏梭菌專用液體培養基中，42 ℃條件下厭氧培養24 h，取0.5 mL 培養菌液，經離心沉淀、溶菌酶處理后使用細菌基因組提取試劑盒提取分離菌的核酸，提取核酸存于-40 ℃保存備用；②引物合成。魏氏梭菌的分型及鑒定引物按照文獻[11]中序列合成，其中α 毒素基因片段為300 bp 左右、β 毒素部分基因片段約為190 bp、ε 毒素基因片段約為650 bp、ι 毒素截短的基因約為440 bp，所有引物由上海生工科技有限公司合成；③PCR 擴增體系。總體系20 μL：2XPower Taq Master Mix 10 μL、滅菌水6 μL、上下游引物各0.5 μL（20 μM）、模板3 μL。PCR 反應條件：預變性為94 ℃、3 min；變性條件為94 ℃、15 s，退火條件為44 ℃、20 s，延伸條件為72 ℃、30 s，共30 個循環；循環擴增最后在72 ℃延伸6 min；2～8 ℃保存。取PCR 產物5 μL 進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，120V 運行15 min 后觀察核酸電泳結果，紫外成像儀拍圖片保存。

4）分離菌的藥敏試驗。將培養菌液稀釋后涂板，分別將多西環素、卡那霉素、新霉素、氟苯尼考、環丙沙星、慶大霉素、氨芐西林等藥敏片貼在平板上，厭氧培養12～16 h 后觀察耐藥情況。

5）分離菌外毒素試驗。將單菌落接種于魏氏梭菌專用液體培養基中，42 ℃條件下厭氧培養12 h，取2 mL 菌液于滅菌離心管中離心取上清，使用滅菌生理鹽水進行5 倍稀釋。選取6 只日齡體重相近的小白鼠，3 只作為對照組尾靜脈注射0.2 mL 滅菌生理鹽水，3只作為實驗組尾靜脈注射0.2 mL 稀釋菌液上清。

2 結果

2.1 細菌的分離

在42 ℃溫度下厭氧培養24 h 后在血平板上形成形雙層溶血環的菌落，單菌落表觀呈現灰色、圓形、略顯光滑、微微隆起的雙溶血環（圖1）。在顯微鏡下可見革蘭氏陽性、桿狀粗大桿菌（圖2）。挑取單菌落在卵黃瓊脂板上，菌落周圍呈現圓形、不溶性、不透明白色沉淀物（圖3）。

圖1 綿羊血平板培養

圖2 卵黃瓊脂培養

圖3 魏氏梭菌鏡檢

2.2 產氣莢膜梭菌的分型PCR 鑒定

PCR 鑒定結果顯示在300 bp 和190 bp 位置出現目的片段表明α、β 毒素陽性，ε、ι 毒素、陰性對照無相應條帶出現，該擴增結果表明該分離菌為C 型產氣莢膜梭菌（圖4）。

圖4 魏氏梭菌分型

2.3 藥敏試驗

藥敏試驗表明分離菌對常見抗生素具有不同程度的耐藥性，對頭孢噻呋敏感性最高，對氨芐西林中敏，對多西環素、卡那霉素、新霉素、氟苯尼考、環丙沙星、慶大霉素耐藥。

2.4 外毒素試驗結果

實驗組三只小鼠在攻毒后1 h 出現精神沉郁、行動遲緩、呼吸加快現象，3 h 后全部死亡，對照組小鼠狀態正常，全部存活。

3 討論

產氣莢膜梭菌是條件性致病菌，致病能力主要依靠其外毒素，相關研究顯示其外毒素主要有α、β、ε、ι、γ、δ、θ、η、κ、λ、μ、υ 等12種，根據其致病力較強的主要的前四種外毒素可將產氣莢膜梭菌分為A（α）、B（α、β、ε）、C（α、β）、D（α、ε）、E（α、ι）等五種基因型。A型產氣莢膜梭菌產量最高的α 毒素為所有基因型均含有的毒素，其具有細胞毒性，可導致血管滲透性增加，出現皮膚壞死、血小板凝集，使動物發生壞死性腸炎等癥狀；B 型可產生β 毒素，β 毒素可分為β1、β2 毒素，β1 毒素是一種具有細胞毒性和致死性的強毒素，β2 毒素是最近幾年相關學者從C 型產氣莢膜梭菌發現的新毒素，與β1 毒素相似。B 型和D 型產氣莢膜梭菌感染易引起牛、羊的腸炎或腸毒血癥，當前E 型導致的臨床致病案例較少[12-14]。在最新的研究中又有新的基因型被添加到這個分型系統中，包括產氣莢膜梭菌的F 型和G 型[15-16]。

產氣莢膜梭菌的毒素可引起人類和動物不同的腸道疾病，這些疾病是由產氣莢膜梭菌的一種或多種毒素介導的，在與產氣莢膜梭菌相關的腸道感染中，C 型菌株引起人和動物的感染，其可引起羊猝狙，該病的主要特征為急性死亡、會導致腹膜炎和潰瘍性腸炎的一種毒血癥，急性腹痛，糞便中帶血。該病的發生與采食C 型產氣莢膜梭菌污染的飼料或飲水有關，多發生在1～2 歲的成年綿羊或山羊，呈現出明顯的地方性流行趨勢，常在冬春季節的低洼、潮濕地區發生。細菌進入腸道后在小腸大量繁殖，迅速產生并釋放毒素，引起羊只發病。發病羊癥狀多出現機體消瘦、跟不上羊群、時常臥地不起、精神煩躁、昏迷或痙攣等，病程短促常于數小時內死亡[17]。

產氣莢膜梭菌普遍存在于環境中，是腸道微生物群的正常成員，當突然改變飲食、抗生素過度治療或天氣突然變化時，導致動物受到應激，免疫抵抗力下降，腸道微生物菌群平衡失調，產氣莢膜會快速生長，大量產氣和分泌多種腸毒素，短時間內可導致羊只死亡。同時，該菌能產生廣泛的胞外毒素和水解酶，在有氧環境中有一定的存活數量。加強環境消毒、異地運輸過程中提前應用一些抗應激物、定期飼喂一些中藥制劑和按時免疫羊三聯四防疫苗，可以較為有效的預防羊梭菌病的發生，降低梭菌病對養羊業造成的經濟損失。■