重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗（H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株）對蛋雞免疫抗體監測試驗研究

孫心，李麗，李叔偉

（1.哈藥集團生物疫苗有限公司 哈爾濱 150040；2.遼寧省盤錦市檢驗檢測中心 遼寧盤錦 124000；3.齊齊哈爾大學 黑龍江齊齊哈爾 161000）

1 材料

1.1 疫苗及試劑

重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗(H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株)，哈藥集團生物疫苗有限公司生產。

抗體監測試劑禽流感H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株以及H7N9 Re-4株抗原及陽性血清，由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所提供；1%紅細胞懸液，哈藥集團生物疫苗有限公司質量管理部提供，為SPF 級公雞紅細胞。

禽流感H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株以及H7N9 Re-4株抗原及陽性血清，購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所；紅細胞懸液（SPF 級公雞紅細胞），由哈藥集團生物疫苗有限公司提供。

1.2 試驗雞群

15日齡海蘭白蛋雞3 300 只，黑龍江省哈爾濱市某蛋雞養殖場提供，其中正常免疫雞群3 000 只，應激試驗用300 只。

禽流感H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株以及H7N9 Re-4株抗原及陽性血清，由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所；紅細胞懸液（SPF 級公雞紅細胞），購自哈藥集團生物疫苗有限公司提供。

2 方法

2.1 免疫劑量及方法

首免：15日齡，免疫劑量0.3 mL/羽，頸部皮下注射。二免：45日齡，免疫劑量0.5 mL/羽，肌肉注射。三免：75日齡，免疫劑量0.5 mL/羽，肌肉注射。四免：100日齡，免疫劑量0.5mL/羽，肌肉注射。

分為四組，A 組雞群只接種一次，首免：15日齡，免疫劑量0.3 mL/羽，頸部皮下注射；B 組雞群接種兩次，首免：15日齡，免疫劑量0.3 mL/羽，頸部皮下注射。二免：45日齡，免疫劑量0.5 mL/羽，肌肉注射。C 組雞群免疫三次，首免：15日齡，免疫劑量0.3 mL/羽，頸部皮下注射。二免：45日齡，免疫劑量0.5 mL/羽，肌肉注射。三免：75日齡，免疫劑量0.5 mL/羽，肌肉注射。D 組雞群免疫四次，首免：15日齡，免疫劑量0.3 mL/羽，頸部皮下注射。二免：45日齡，免疫劑量0.5 mL/羽，肌肉注射。三免：75日齡，免疫劑量0.5 mL/羽，肌肉注射。四免：100日齡，免疫劑量0.5 mL/羽，肌肉注射。

2.2 血樣采集

15日齡免疫前先測定基礎抗體，然后于29日齡（首免后2周）、36日齡（首免后3 周）、43日齡（首免后4 周）、52日齡（二免后1 周）、59日齡（二免后2 周）、66日齡（二免后3 周) 、73日齡（二免后4 周）、82日齡（三免后1 周）89日齡（三免后2 周）、97日齡（三免后3 周）、104日齡（三免后4 周）、111日齡（三免后5 周）、118日齡、148日齡、178日齡、208日齡、238日齡、268日齡、298日齡，每次分別每組采集10 份血樣，離心制備血清并按照國家標準紅細胞血凝抑制試驗（HI）進行抗體檢測，各組別采血日齡見表1。

表1 各組別采血日齡

2.3 檢測試劑和檢測方法

各組隨機取20 只雞翅靜脈采血，離心制備血清，按照現行《中國獸藥典》附錄紅細胞血凝抑制試驗（HI）進行抗體效價檢測。待檢血清HI 抗體效價≥4 為抗體合格。

2.4 應激試驗

300 只雞分為五組，每組60 只，A 組（15日齡接種0.3 mL/羽）；B 組（15日齡接種0.5 mL/羽）；C 組（75日齡接種0.5 mL/羽）；D 組（75日齡接種0.8 mL/羽）；F 組（75日齡接種1 mL/羽）。接種后通過吸收時間，精神狀態，采食量觀察不同劑量H5+H7亞型三價滅活疫苗對雞群的應激情況。

3 試驗結果

3.1 重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗接種后的抗體消長規律

1）雞群免疫一次重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗檢測試驗雞不同日齡的抗體效價，結果見表2 和圖1。

圖1 一次免疫重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗各毒株抗體消長規律

表2 試驗雞群免疫一次重組禽流感三價滅活疫苗后各日齡的抗體效價（lb）

15日齡海蘭白蛋雞接種0.3 mL/羽H5+H7亞型三價滅活疫苗，監測結果H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株、H7N9 Re-4株抗體效價在29日齡分別是5.2、5.3 和5.3 lb，在52日齡抗體值達到最高值，分別是8.8、8.9 和8.7 lb，73日齡開始抗體值開始逐步下降，分別是7.8 、7.7 和7.5 lb，從結果看三價滅活疫苗15日齡免疫一次，可有效保護到蛋雞73日齡，不能有效地保證蛋雞開產前H5+H7亞型三價滅活疫苗抗體水平在6 lb 以上。

2）雞群免疫兩次重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗。

檢測試驗雞不同日齡的抗體效價，結果見表3 和圖2。

圖2 二次免疫重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗各毒株抗體消長規律

表3 試驗雞群免疫一次重組禽流感三價滅活疫苗后各日齡的抗體效價（lb）

15 和45日齡海蘭白蛋雞分別接種0.3 mL/羽和0.5 mL/羽H5+H7亞型三價滅活疫苗，監測結果H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株、H7N9 Re-4株抗體效價在29日齡分別是5.2、5.3 和5.3 lb，在73日齡抗體值達到最高值分別是9.4、9.2 和9.3 lb，97日齡開始抗體值開始逐步下降，分別是8.9、8.9 和8.7 lb，在蛋雞開產前118日齡時抗體值分別是7.0、7.0 和6.9 lb，從結果看三價滅活疫苗15 和45日齡免疫二次，可有效保護到蛋雞118日齡，能有效地保證蛋雞開產前H5+H7亞型三價滅活疫苗抗體水平在6 lb 以上。

3）雞群免疫三次重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗

檢測試驗雞不同日齡的抗體效價，結果見表4 和圖3。

圖3 三次免疫重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗各毒株抗體消長規律

表4 試驗雞群免疫三次重組禽流感三價滅活疫苗后各日齡的抗體效價（lb）

15、45 和75日齡海蘭白蛋雞分別接種0.3、0.5 和0.5 mL/羽H5+H7亞型三價滅活疫苗，監測結果H5N6 Re-13株、H5N8Re-14株、H7N9 Re-4株抗體效價在29日齡分別是5.4、5.3 和5.3 lb，在73日齡抗體值達到最高值，分別是9.4、9.2 和9.3 lb，118日齡開始抗體值開始逐步下降，分別是8.9、9.2 和9.2 lb，在蛋雞開產后208日齡時抗體值分別是6.5、6.6 和6.3 lb，從結果看三價滅活疫苗15日齡、45日齡、75日齡免疫三次，可有效保護到蛋雞208日齡，能有效的保證蛋雞開產前和開產后前期H5+H7亞型三價滅活疫苗抗體水平在6 lb 以上。

4）雞群免疫四次重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗

檢測試驗雞不同日齡的抗體效價，結果見表5 和圖4。

圖4 四次免疫重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗各毒株抗體消長規律

15、45 和75日齡、100日齡海蘭白蛋雞分別接種0.3、0.5、0.5和0.5 mL/羽H5+H7亞型三價滅活疫苗，監測結果H5N6Re-13株、H5N8 Re-14株、H7N9 Re-4株抗體效價在29日齡分別是5.4、5.3和5.3 lb，在73日齡抗體值達到最高值，分別是9.4、9.2 和9.3 lb，208日齡開始抗體值開始逐步下降，分別是9.1、9.0 和8.9 lb，在蛋雞開產后298日齡時抗體值，分別是6.9、7.0 和6.9 lb，從結果看三價滅活疫苗15、45 和75日齡、100日齡免疫四次，可有效保護到蛋雞298日齡，能有效的保證蛋雞開產前和產后高峰期H5+H7亞型三價滅活疫苗抗體水平在6 lb 以上。

3.2 不同日齡海蘭白蛋雞接種重組禽流感H5+H7亞型三價滅活疫苗的應激反應

試驗雞應激反應情況見表6。

表6 不同日齡海蘭白蛋雞接種重組禽流感H5+H7亞型三價滅活疫苗的應激反應

不同日齡的雞群接種不同劑量的重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗（H5 N1 Re-13株、Re-14株+H7N9 Re-4），從完全吸收時間、精神狀態、采食量方面來評價接種疫苗后對雞群應激狀況的影響，接種最大劑量1 mL/羽時，疫苗對雞群應激影響是一過性的，2～3 d 可以恢復。那么由于是臨床上飼養的蛋雞群，飼養管理，溫度，濕度等都會對雞群造成一定的影響，還有就是疫苗回溫對應激的影響也是存在的，建議疫苗回溫時間1～1.5 h。

4 結論

4.1 免疫次數選擇

對于蛋雞開產前免疫重組禽流感病毒（H5+H7）三價滅活疫苗次數，從試驗結果得出結論，兩次免疫只能對蛋雞開產前有較好的保護作用，不能對蛋雞開產后產生較好的保護作用，而三次免疫雖然能對蛋雞開產后產生較好的保護力，但是保護時間較短，能保護到208日齡作用，不能保護蛋雞開產高峰期，而蛋雞四次免疫，不僅能有效的保護蛋雞開產前而且還能很好地對蛋雞開產后的產蛋高峰期有較好的保護作用，這樣在蛋雞開產后，尤其是在產蛋高峰期期間盡可能不對高產蛋雞接種重組禽流感病毒（H5+H7）三價滅活疫苗，可以減少滅活疫苗對產蛋高峰期蛋雞產生的應激，盡量不影響蛋雞高峰期的產蛋率。在蛋雞飼養過程中，會受到養殖環境、飼料、飲水、疫苗接種時間、疫病流行情況等因素的影響，所以會對蛋雞接種重組禽流感病毒（H5+H7）三價滅活疫苗產生的抗體產生一定的影響，所以，要盡可能結合實驗室對蛋雞抗體值檢測的具體結果，來制定對蛋雞加強免疫重組禽流感病毒（H5+H7）三價滅活疫苗的時間，這樣可以使蛋雞在整個生長和生產期都有較好的抗體值，減少雞群高致病性禽流感的發生。

4.2 疫苗安全性試驗

養殖戶往往對禽流感疫苗的應激反應有所顧忌，尤其是在蛋雞開產后擔心加強接種高致病性禽流感疫苗會影響蛋雞的產蛋率，本試驗通過安全性試驗和對不同日齡蛋雞接種高致病性禽流感疫苗應激反應觀察雞群狀態，沒有異常，說明重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗對雞群沒有應激作用，安全性高?！?/p>