高效裂解性寬譜大腸桿菌噬菌體篩選方法探究

屈平平，楊明彩，溫華梅，李濤

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東濰坊 261061）

近年來，隨著畜牧業(yè)“禁抗減抗”執(zhí)行力度的加大和國家對食品安全的重視，噬菌體，作為細(xì)菌的天然殺手，具有特異性強、繁殖速度快、不易產(chǎn)生耐藥性、對真核細(xì)胞無毒副作用等優(yōu)勢[1-2]，噬菌體及裂解酶在疾病治療、環(huán)境消毒、食品保存等方面的應(yīng)用越來越廣泛[3-5]。如何從自然界篩選到效價高、暴發(fā)量大、裂解譜廣、抗逆性強的裂解性噬菌體，是噬菌體及其裂解酶研究和開發(fā)利用的根本。本試驗以免致病性大腸桿菌為宿主菌，研究了高效裂解性寬譜大腸桿菌噬菌體的篩選方法，為下一步大腸桿菌噬菌體的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1）污水：取自山東地區(qū)（青島、濰坊、臨沂、萊蕪）肉兔養(yǎng)殖較為密集的養(yǎng)殖場周邊污水。

表1 污水采集地區(qū)及標(biāo)號

2）指示菌：用于篩選噬菌體的宿主菌為本實驗室保存的11株兔腸源致病性大腸桿菌。

3）主要試劑與儀器：麥康凱培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基等，均購自北京路橋技術(shù)有限公司；甘油，購自煙臺遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司；SM 緩沖液，購自北京雷根生物有限公司。主要儀器由一次性注射器，一次性0.22 μm 微孔針式過濾器，超凈工作臺、水浴鍋、透射電子顯微鏡（HT7700 型，HITACHI）。

1.2 培養(yǎng)基制備

1）麥康凱培養(yǎng)基：取10 g，加入200 mL 蒸餾水，121 ℃高壓15 min，冷卻至50 ℃，倒板備用。

2）LB 液體培養(yǎng)基：分別稱取胰蛋白胨10 g、酵母浸膏粉5 g 和NaCl 10 g，加入蒸餾水1 L，加熱并不斷攪拌至其溶解，121 ℃高壓滅菌15 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3）LB 固體培養(yǎng)基：分別稱取胰蛋白胨10 g、酵母浸膏粉5 g、NaCl 10 g 和瓊脂粉15 g，加入蒸餾水1 L，加熱并不斷攪拌至其溶解，121 ℃高壓滅菌15 min，室溫冷卻至50 ℃左右，倒入高壓滅菌的平皿中，冷卻凝固，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4）LB 半固體培養(yǎng)基：稱量5 g LB 肉湯，1.4 g 瓊脂粉，加入含有200 mL 蒸餾水的錐形瓶中，攪拌均勻，煮沸至完全溶解，對其進行滅菌處理，滅菌完成后保存?zhèn)溆谩?/p>

2 試驗方法

2.1 宿主菌菌液的制備

取-80 ℃保存的11株兔源大腸桿菌（編號為tE1-tE11）在麥康凱培養(yǎng)基上劃線純化，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，挑取純化后的單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)8 h 至對數(shù)期，得到大腸桿菌菌懸液。

2.2 可疑噬菌體的初選

分別取10mL 污水（編號為1#-12#）于帶蓋塑料離心管中，12 000 r/min 離心10 min 去除大部分固體雜質(zhì)，上清液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌。取0.1 mL 污水過濾液加入10 mL 已滅菌LB 液體培養(yǎng)基中，再加入0.1 mL 宿主菌菌液，37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜，次日將5 mL 培養(yǎng)液8 000 r/min 離心15 min，上清液經(jīng)過經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，將過濾液保存與無菌青霉素，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

利用滴定法檢測污水中有無噬菌體存在，取100 μL 大腸桿菌菌懸液涂布于LB 固體培養(yǎng)基平板上，在平板背面畫出分割線并進行標(biāo)號，根據(jù)平板標(biāo)號點滴樣品濾液，每個標(biāo)號方格中滴加10 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，觀察有無空斑出現(xiàn)?？瞻叽蠖噶琳撸f明該污水中可能含有裂解性比較強的噬菌體（如圖1 中4#、6#和7#污水中可能存在能高效裂解宿主菌tE1 的噬菌體）?？瞻咝。瑴啙幔瑑?nèi)有少量細(xì)菌者，說明該污水中雖然存在能裂解該細(xì)菌的噬菌體，但裂解不徹底，裂解能力較差（如圖1 中8#和9#污水中存在的噬菌體裂解宿主菌tE1 能力相對差）。優(yōu)選空斑大而透亮者，再進一步進行噬菌體的分離和純化。

圖1 滴定法檢測污水中有無噬菌體的演示

2.3 寬譜噬菌體的篩選

將大而透亮的空斑用無菌眼科手術(shù)鑷摳出，加入10 mL LB 液體培養(yǎng)基，再加入100 μL 宿主菌菌懸液，37 ℃180 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜，次日將噬菌體增殖液過0.22 μm 濾膜，得到噬菌體過濾液。然后進行交叉滴定試驗，即利用一種噬菌體過濾液滴定其他噬菌體的宿主菌，看有無空斑出現(xiàn)，出現(xiàn)空斑較多者，說明該噬菌體的裂解譜較寬，有可能為寬譜噬菌體。

2.4 噬菌體的分離與純化

將疑似寬譜噬菌體的過濾液進行梯度稀釋，取合適梯度噬菌體稀釋液0.1 mL 與0.2 mL 宿主菌菌液混合，加入4mL 約55 ℃LB半固體培養(yǎng)基，混勻后倒入LB 平板上，平板凝固后倒置于37 ℃培養(yǎng)箱4～6 h，觀察噬菌斑大小、形狀及透明度，并記錄噬菌體效價。將有透亮噬菌斑，且效價較高的樣品，利用雙層平板法進一步純化，重復(fù)3～5 次后，最終得到噬菌斑透而亮，形狀和大小一致。

2.5 噬菌體的分類與命名

將篩選的寬譜噬菌體，用磷鎢酸負(fù)染法進行透射電鏡觀察。取富集后的噬菌體緩沖液15 μL 滴于銅網(wǎng)上，靜置15 min，用濾紙吸干多余液體，然后滴一滴磷鎢酸（2%）染色，等待10min，干燥后通過電子顯微鏡觀察其形態(tài)。根據(jù)《根據(jù)國際病毒分類委員會（ICTV）在2011年發(fā)布的第9 次報告中噬菌體的分類與命名標(biāo)準(zhǔn)》[6]和相關(guān)文獻[7]對噬菌體進行分類和命名。

3 試驗結(jié)果

3.1 噬菌體的初步篩選

通過噬菌體原液滴定宿主菌，在普通平板上空斑的情況見表2和圖2，其中空斑大而透亮的有tE1-2#、tE1-5#、tE1-7#、tE1-9#、tE1-10#、tE2 -9#、tE2 -10#、tE5 -2#、tE5 -5#、tE5 -9#、tE5 -10#、tE5 -11#、tE6-2#、tE6-5#、tE6-9#、tE6-10#、tE6-11#、tE10-11#，因此，利用滴定法初步篩選到18株裂解性比較強的噬菌體。

圖2 滴定試驗出現(xiàn)空斑的情況

表2 滴定法初次篩選噬菌體的結(jié)果

3.2 寬譜噬菌體的篩選

利用一種噬菌體過濾液滴定其他噬菌體的宿主菌，出現(xiàn)空斑的情況見表3?？芍删wtE6-5#除了可以裂解宿主菌tE6，還可裂解宿主菌tE1、tE2、tE5、tE10；噬菌體tE10-11#可以裂解宿主菌tE10，還可裂解宿主菌tE1、tE2、tE5、tE6；其他噬菌體僅能裂解1 種或者2 種宿主菌。因此，噬菌體tE6-5#和噬菌體tE10-11#很可能為寬譜噬菌體。

表3 寬譜噬菌體的篩選結(jié)果

3.3 疑似寬譜噬菌體的分離和純化結(jié)果

經(jīng)過純化后，tE6-5#的噬菌斑為圓形，直徑約0.8～1 mm，邊緣整齊無暈環(huán)，完全透亮（見圖3），效價為5.42×108PFU/mL。tE10-11#的噬菌斑圓形，直徑約2～2.5 mm，邊緣整齊無暈環(huán)，完全透亮（見圖4），效價為8.26×109pfu/mL。

圖3 tE6-5# 噬菌斑形態(tài)

圖4 tE10-11# 噬菌斑形態(tài)

3.4 噬菌體的分類與命名

通過透射電鏡觀察到噬菌體tE6-5#，平面觀察頭部大致呈長六角形，長徑約為59.6 nm，橫徑約為57.3 nm，尾部長約106 nm，無明顯的頸部（見圖5），從形態(tài)和結(jié)構(gòu)上可初步判定該噬菌體屬于有尾噬菌體目，肌尾噬菌體科，暫命名為vB-EcoM-tE6。噬菌體tE10-11#，頭部呈二十面體，長徑約為52.5 nm，橫徑約為51.6 nm，尾部長約86.9 nm，有明顯的頸部（見圖6），從形態(tài)和結(jié)構(gòu)上可初步判定該噬菌體也屬于有尾噬菌體目，肌尾噬菌體科，暫命名為vB-EcoM-tE10。

圖5 vB-EcoM-tE6 電鏡形態(tài)

圖6 vB-EcoM-tE10 電鏡形態(tài)

4 討論

近年來，眾多研究者以禽源、羊源、豬源致病性大腸桿菌等為宿主菌，篩選了多株大腸桿菌噬菌體，并對其生物學(xué)特性和分子生物學(xué)信息進行了深入的研究[8-11]。旨在篩選出安全、高效、潛在利用價值高的寬譜裂解性噬菌體。由于自然界中的噬菌體種類和數(shù)量多，特異性強，理想型噬菌體的篩選成為噬菌體開發(fā)和利用的前提，也是研發(fā)工作中最為繁瑣的環(huán)節(jié)。

本項目組探索了一套省時省力、高效篩選目的噬菌體的方法。首先是利用滴定法根據(jù)空斑的大小和透明度，初步篩選出裂解能力較強的噬菌體，再利用交叉滴定法，篩選出能夠裂解多株宿主菌的寬譜噬菌體，最后利用雙層平板法，篩選和純化出效價高、噬菌斑大而透的噬菌體。這種方法可以避免一開始就利用雙層平板法初選噬菌體和盲目對大量未知噬菌體的分離和純化過程中時間、精力、試驗材料的消耗，大大提高了科研工作的效率，在很大程度節(jié)約了試驗耗材和試劑的投入。

根據(jù)電鏡下噬菌體形態(tài)學(xué)特征，本試驗從萊蕪和青島某兔場污水種中分離的大腸桿菌噬菌體vB-EcoM-tE6 和vB-EcoM-tE10 均為有尾噬菌體目、肌尾噬菌體科。與趙劍等[12]以一株兔非典型腸致病型大腸桿菌（ZR1）為宿主菌，分離到的噬菌體ZRP1；與王志鵬等[13]以1株致病性大腸埃希菌為宿主菌，分離純化的出4株噬菌體ZRP2、ZRP3、ZRP4 和ZRP5，在形態(tài)上具有相似性，符合大腸桿菌噬菌體的一般特征。噬菌體vB-EcoM-tE6 和vB-EcoM-tE10 的效價在109～1010之間，至少能裂解5 種以上的致病性大腸桿菌，符合高效裂解性寬譜噬菌體的特點，很可能具有很高的開發(fā)和利用價值。■