紫草素聯合半導體激光預防釉質脫礦的體外研究

范文獻, 范譯丹, 趙 今, 李新尚

(新疆醫科大學第一附屬醫院(附屬口腔醫院)1牙體牙髓科, 2口腔修復科, 3口腔急診綜合科, 烏魯木齊 830054)

齲病是一種常見的慢性進行性的炎癥感染性口腔疾病,根據第四次全國口腔健康流行病學調查報告顯示,12歲以下兒童恒牙齲患率為34.5%,5歲一下兒童乳牙齲患率為70.9%[1]。齲病是由于牙釉質表面脫礦,鈣、磷酸根離子在酸性作用下從牙釉質中溶解,導致牙釉質脫礦[2]。通常氟化物中的氟離子取代牙齒表面的羥基形成溶解度更低的氟磷灰石,大大降低了齲齒患病率。氟化物大量的應用也提高了氟斑牙和氟骨癥的發病率[3]。含氟產品仍不足以解決易感人群的患齲風險,因此尋找一種可替代的預防手段成為目前研究的熱點。紫草素(Shikonin)是紫草中一種萘醌類化合物,已被廣泛用于食品及化妝品的著色劑,臨床多用于肝炎、扁平疣以及燒傷的治療[4-6]。本課題組前期研究發現紫草素對口腔致齲細菌及其生物膜的生長、產酸、產糖以及黏附等致齲毒力因子有明顯抑制的作用[7]。目前臨床上多采用激光治療齲病,具有安全快捷、快速有效的特點,深受臨床推崇。半導體激光器是一種小巧便攜的激光器,易于應用,成本較低,產生的熱量較少,且不會對搪瓷表面造成熱損傷。本研究采用人牙釉質塊模型探究半導體激光聯合紫草素的無創防齲效果,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥紫草素(上海源葉生物科技公司,批號517-89-5),再礦化液(北京索萊寶科技有限公司,批號A8990),溴麝香草酚(北京索萊寶科技有限公司,批號T8690),磷酸鹽緩沖液(上海通蔚實業有限公司,批號TW25181),磷酸二氫鉀(天津市大茂化學試劑廠,批號3190),硝酸鈣(天津市大茂化學試劑廠,批號3189),乙酸(天津市大茂化學試劑廠, 批號3139),氫氧化鈉(天津市大茂化學試劑廠,批號3197),氟化鈉(NaF,天津市大茂化學試劑廠,批號4399)。

1.2 儀器低速金剛石鋸(長沙眾邦醫療器械有限公司),HTV-PHS30顯微維氏硬度計(北京聚瑞眾邦科技有限公司),Dimension icon XR原子力顯微鏡(德國布魯克公司),ESCALAB 250Xi -X射線能譜儀(美國賽默飛世爾科技公司),JSM-6390LV掃描電子顯微鏡(日本電子株式會社,),XS1003S電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司),PHS-3B型pH計(上海雷磁儀器廠),HH.S11-1水浴鍋(上海博迅科技有限公司)。

1.3 溶液的配制(1)0.1%溴麝香草酚溶液:取1 g溴麝香草酚用1 mL無水乙醇溶解后,加入1 000 mL的無菌蒸餾水,配制成 0.1%的溴麝香草酚溶液。(2)磷酸鹽緩沖液:取0.2 mol/L磷酸二氫鉀溶液250 mL,0.2 mol/L氫氧化鈉溶液18 mL加入1 000 mL的燒瓶中,用去離子水稀釋至刻度,搖勻即得。(3)脫礦液:取2.2 mmol/L硝酸鈣0.26 g、2.2 mmol/L磷酸二氫鉀0.15 g、50 mmol/L乙酸1.5 g,加入1 000 mL的燒瓶中,用去離子水稀釋至1 000 mL,氫氧化鈉調節pH=4.8,搖勻即得。(4)紫草素母液:用電子天平秤稱取紫草素32 mg,溶于1 mL的二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)中,即得濃度為32 mg/mL的紫草素母液,于-80℃冰箱中儲存,備用。(5)取5 g氟化鈉用100 mL去離子水溶解,配制成5%的氟化鈉溶液。

1.4 離體牙的收集收集2021年12月-2022年7月在新疆醫科大學第一附屬醫院(附屬口腔醫院)就診的15～20歲因正畸減數拔牙的新鮮前磨牙或第三磨牙,術前片顯示根尖孔發育完全、冠根均無齲、無裂紋、無氟斑牙、無四環素牙、無牙釉質發育不全或礦化不全,按照以上標準共收集標本180顆。去除牙釉質表面結石和菌斑,超聲清洗30 min,備用。

1.5 樣本制備將90顆牙自然晾干,石蠟包埋后用低速金剛石鋸切割成5 mm×5mm×3mm 釉質塊,在蒸餾水下依次用800、1 200、2 400目碳化硅砂紙磨平拋光釉質面,磨除厚度0.1 mm,用碳鉛筆在樣本釉質面畫出一個水平矩形區域(3 mm×3 mm)作為暴露窗口,其余部分涂布2層抗酸指甲油,用去離子水沖洗后存于0.1%溴麝香草酚溶液中備用。

1.6 脫礦流程將“1.5”項下制備的釉質樣本隨機分為6組:對照組、紫草素組、激光組、NaF組、激光聯合NaF組、激光聯合紫草素組,每組15個樣品。將各組樣品37℃下浸入15 mL脫礦液(pH=4.8)中脫礦72 h,100%濕度下連續培養3 d,每天更換脫礦液1次。

1.7 各組處理方法脫礦期間,對照組:不處理;紫草素組:用紫草素溶液處理樣本實驗區表面5 min(紫草素溶液32 mg/mL,小毛刷均勻涂布),干燥后用去離子水沖洗,每天2次;激光組:用激光照射樣本實驗區表面15 s(脈沖強度15 Hz,脈沖持續時間30 ms,光圈直徑400 pm,照射距離5 mm,采用連續波模式),干燥后用去離子水沖洗,每天2次;激光+NaF組:同激光組處理方法,然后用5%NaF溶液處理樣本實驗區表面5 min,干燥后用去離子水沖洗,每天2次;NaF組:用5%NaF溶液處理樣本實驗區表面5 min,干燥后用去離子水沖洗,每天2次;激光+紫草素組:同激光組處理方法,然后用紫草素處理樣本實驗區表面5 min,干燥后用去離子水沖洗,每天2次。

1.8 指標測定

1.8.1 樣本表面顯微硬度的測量 每個樣本脫礦前隨機選取5個點施加50 g 的力持續10 s,采用維氏顯微硬度計測量樣本表面顯微硬度,計算公式:VHN=F/A,其中:VHN為表面顯微硬度,F為載荷(千克力),A為表面積(mm2),計算5個點的平均顯微硬度為初始硬度值。脫礦實驗完成后,同法測定脫礦后硬度值。比較各組脫礦前后樣本表面顯微硬度值,表面顯微硬度值越高,表示樣本表面脫礦越輕。

1.8.2 樣本表面形貌、粗糙度(Rq , Ra)和脫礦深度(VD)的測量 采用原子力顯微鏡(AFM)在空氣環境中進行測量,采用輕敲模式,針尖曲率半徑為8 nm,力常數為40 N/m,共振頻率331.179 kHz的硅探針,掃描范圍為10 μm×10 μm,掃描頻率為0.5 Hz。通過原子力顯微鏡分析軟件NanoScope Analysis分析樣品表面形貌、粗糙度(Rq , Ra)和脫礦深度(VD)。

1.8.3 樣本表面的元素分析 將釉質樣本用無水酒精進行脫水,安裝在粘有非導電膠的觀測臺上,經干燥、真空條件鏡下觀察漂白后釉質樣本表面的形態變化(電壓 20 KV),在各組釉質樣本上隨機選擇4個位點,分別在500、1 000、2 000、5 000 倍鏡下拍攝圖像。將各組釉質塊進行能譜分析,計算分析各組釉質塊中鈣、磷元素含量,計算鈣磷摩爾比,鈣磷摩爾比越大表示脫礦越小。

2 結果

2.1 各組樣本牙釉質脫礦前后表面顯微硬度比較脫礦前各組樣本牙釉質表面顯微硬度差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組、紫草素組、激光組比較,激光聯合紫草素組顯微硬度值增大,差異有統計學意義(P<0.05);與激光聯合NaF組比較,激光聯合紫草素組顯微硬度值減小,差異有統計學意義(P<0.05);與NaF組比較,激光聯合紫草素組顯微硬度值差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 各組樣本牙釉質脫礦前后表面顯微硬度比較

2.2 各組脫礦后牙釉質表面粗糙度(Rq, Ra)、脫礦深度(VD)比較與對照組、紫草素組、激光組比較,激光聯合紫草素組表面粗糙度和脫礦深度減小,差異有統計學意義(P<0.05);與激光聯合NaF組比較,激光聯合紫草素組表面粗糙度和脫礦深度增大,差異有統計學意義(P<0.05);與NaF組比較,激光聯合紫草素組表面粗糙度和脫礦深度差異無統計學意義(P>0.05),見表2。

表2 各組脫礦后牙釉質塊表面粗糙度,脫礦深度

2.3 各組脫礦后牙釉質塊表面形貌情況通過原子力顯微鏡3D模型重建觀察發現,對照組:樣本表面高低起伏不平,有許多被酸侵蝕的凹陷,呈現出不規則的形態,峰很高,波谷很低,牙釉質表面釉柱完全暴露,柱間牙釉質完全溶解,釉柱間隙增大(見圖1a)。紫草素組:樣本表面高低起伏范圍和程度較對照組有所減小,但是表面也有許多被酸侵蝕的凹陷呈現出不規則的形態,牙釉質表面釉柱暴露,柱間牙釉質基本溶解,釉柱間隙增大(見圖1b)。激光組:樣本表面高低起伏范圍和程度較紫草組有所減小,表面也有被酸侵蝕的凹陷呈現出不規則的形態,牙釉質表面釉柱暴露,柱間牙釉質基本溶解,釉柱間隙增大(見圖1c)。激光聯合NaF組:樣本表面光滑平坦,牙釉質表面釉柱輕微暴露(見圖1d)。NaF組:樣本表面較為光滑,表面地貌較為平坦,牙釉質表面釉柱輕微暴露(見圖1e)。激光聯合紫草素組:樣本表面較為粗糙,表面地貌較為平坦,牙釉質表面釉柱輕微暴露有,在釉柱區域表現出輕微的礦物質損失(見圖1f)。

注: a: 對照組, b: 紫草素組, c: 激光組, d: 激光聯合NaF組, e: NaF組, f: 激光聯合紫草素組。圖1 各組脫礦后樣本表面形貌3D模型圖

2.4 各組脫礦后牙釉質塊表面元素分析的比較與對照組比較,激光聯合紫草素組表面鈣磷元素摩爾比值增大,差異有統計學意義(P<0.05)。與激光聯合NaF組、NaF組比較,激光聯合紫草素組表面鈣磷元素摩爾比值減小,差異有統計學意義(P<0.05);與激光組、紫草素組比較,激光聯合紫草素組表面鈣磷元素摩爾比值差異無統計學意義(P>0.05),見表3,圖2。

表3 各組脫礦后牙釉質塊表面鈣磷摩爾比

注: a: 對照組, b: 紫草素組, c: 激光組, d: 激光聯合NaF組, e: NaF組, f: 激光聯合紫草素組。圖2 各組脫礦后牙釉質塊表面元素分析圖

3 討論

預防齲齒是現代口腔領域的主要目標之一,包括預防牙齒脫礦及促進其再礦化,處理方式不再是傳統的去腐和填充,而是通過無創手段來達到這一目標[8]。再礦化是牙齒恢復礦物質的修復過程,通過唾液中的鈣、磷酸鹽和氟化物的交換而發生[9]。脫礦和再礦化之間的動態平衡始終保持在一個相對穩定的階段,當細菌產酸攻擊牙釉質時有可能打破這種平衡,導致釉質傾向于脫礦方向發展,最終導致齲損的形成[10-11]。氟化物在增強再礦化方面有著重要作用,局部應用氟化物是阻止或預防齲齒的有效方法[12]。氟離子可以取代羥基磷灰石中的羥基,導致氟磷灰石的形成,由于氟磷灰石在酸中的溶解度低于羥基磷灰石,因此在酸性環境下具有更高的抵抗力[13-14]。

紫草素(Shikonin)是從紫草(Lithospermumerythrorhizon,Onosmapaniculata或Arnebiaeuchroma)的干燥根中提取的一種活性成分,具有抗菌消炎,抗血管生成等活性[15-18],在觸發活性氧的產生,抑制外泌體釋放,誘導細胞凋亡方面起著至關重要的作用[19-22]。

研究表明當存在氟化物、鈣或磷離子時,激光照射可以通過改變其化學形態結構促進再礦化過程,從而增強牙釉質的耐酸性[23]。加熱牙釉質可以引起牙釉質的化學改變,增強抗齲齒能力。然而,光熱相互作用通常伴隨著對牙釉質表面的不利形態變化,例如裂紋。半導體激光器在羥基磷灰石中的吸收系數較低,能量多以熱量的形式散射,對牙釉質表面的完整性沒有損害[24]。此外,半導體激光器體積小,便于攜帶,易于應用且價格合理,這些優點使其成為預防齲齒的首選激光器。牙科應用的半導體激光器發射波長范圍為800～1 064 nm[25]。在可見光譜內發出藍光的445 nm半導體激光器已在臨床廣泛使用,其被色素組織和膠原蛋白吸收較高,是傳統紅外半導體激光器的10倍[26-27],且半導體激光照射可以增加人體牙釉質中氟化物的攝取[28]。

本研究表明,紫草素聯合半導體激光處理的樣本顯微硬度較高,表面粗糙度和脫礦深度較小,表明紫草素聯合半導體激光可以預防牙釉質脫礦,效果優于紫草素組。綜上所述,半導體激光照射后聯合紫草素可以明顯提高預防脫礦的效果。