維生素D通過Nrf2/HO-1抑制鐵死亡緩解6-羥基多巴胺所致PC12細胞損傷的作用機制研究

穆清爽, 李沛珊, 李艷霞, 李瑞晟, 楊新玲

(1新疆醫科大學第二附屬醫院干部一科, 新疆神經系統疾病研究重點實驗室, 2新疆醫科大學第二附屬醫院神經內科,3新疆醫科大學第二附屬醫院康復科, 烏魯木齊 830063; 4新疆醫科大學, 烏魯木齊 830017)

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是僅次于阿爾茨海默病的第二大神經退行性疾病,占65歲以上人口的2%～3%,主要由位于基底神經節區域黑質致密部(Substantia nigra pars compacta,SNpc)的多巴胺能神經元耗竭引起的[1-2]。遺傳、老齡化、環境、營養等因素均可能與PD發生相關,但其具體發病機制尚不明確[2-3]。多巴胺前體左旋多巴是PD的主要治療藥物,但其治療效果欠佳,不能阻止PD的惡化,甚至還伴隨明顯的毒副作用[4]。作為一種神經保護試劑,維生素D可通過調節神經系統鈣平衡以及影響神經營養因子表達而參與神經系統的代謝,發揮其對PD患者的神經保護作用[5]。維生素D可有效改善缺血缺氧所致神經元細胞損傷,上調神經元中Nrf2和HO-1的表達,導致谷胱甘肽過氧化酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)、超氧化物歧化酶(Super oxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)水平升高,丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量降低,從而抑制鐵死亡[6]。

鐵死亡(Ferroptosis)是新發現的一種鐵依賴的調節性細胞死亡方式,其與核因子E2相關因子2(Nuclear factorE2 related factor 2,Nrf2)/血紅素加氧酶1(Heme oxygenase1,HO-1)通路激活相關[7]。PD患者多巴胺能神經元細胞所沉積的α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn),可引起脂質代謝紊亂及鐵死亡,暗示鐵死亡與PD進展相關[8],抑制鐵死亡可顯著緩解多巴胺能神經元細胞損傷[9]。但PD中,維生素D是否通過調控鐵死亡緩解神經元細胞損傷,報道尚少。為此,本研究擬通過6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)刺激PC12構建體外PD細胞模型[10],維生素D干預后,觀察鐵死亡及Nrf2/HO-1通路激活情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 細胞培養及主要試劑 未分化的PC12(大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞)購自于賽百慷(上海)生物技術股份有限公司(貨號:iCell-r025)。胎牛血清購自于CLARK公司(貨號:FB15015);RPMI 1640培養基購自于美國Gibco公司(貨號:31800-089);6-OHDA(貨號:HY-B1081)、1,25(OH)2D3(貨號:HY-10002)、Erastin(貨號:HY-15763)、ML385(貨號:HY-100523)購自于美國MCE公司;丙二醛(MDA)測定試劑盒(貨號:A003-1-2)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(貨號:A020-2-2)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(貨號:A001-3-2)、還原型谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒(貨號:A006-2-1)購自于南京建成生物工程研究所;一氧化氮(Nitric oxide,NO)測定試劑盒(貨號:S0021S)購自于上海碧云天生物科技有限公司;細胞鐵含量檢測試劑盒(貨號:BC5310)購自于北京索萊寶科技有限公司;RIPA裂解液(貨號:LS-W-03268)、Annexin V-FITC/PI(貨號:LS-H-158)試劑盒、PBS(貨號:LS-P-0106)、Western blot試劑盒(貨號:LS-H-128)購自于武漢靈思生物技術有限公司;Anti-Heme Oxygenase 1(貨號:AF5393)、Nrf2 Antibody(貨號:AF0639)、XCT Antibody(貨號:DF12509)、GPX4 Antibody(貨號:DF6701)、Transferrin Receptor Antibody(貨號:AF5343)購自于美國affinity公司;Anti-GAPDH antibody(貨號:ab8245)、Anti-Ferritin-1(貨號:ab75973)購自于英國abcam公司;HRP標記的山羊抗兔IgG(貨號:GB23303)購自于武漢賽維爾生物技術有限公司;SYBR Green PCR試劑盒(貨號:AQ131)購自于北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 主要儀器 3111型CO2培養箱購自于美國Thermo公司;LC96型Real-time PCR檢測儀購自于美國羅氏公司;Nano-100型微量核酸測定儀購自于杭州奧盛儀器有限公司;HBS-1096A型酶標儀購自于南京德鐵實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PC12細胞培養 PC12細胞復蘇后,置于RPMI 1640,并添加5%胎牛血清、10%熱滅活馬血清和1%的青-鏈霉素于培養基中,培養的氣相條件:空氣95%,二氧化碳5%。培養溫度為37℃,培養箱濕度為70%～80%。

1.2.2 PD細胞模型構建 參考文獻[9-10], 利用40 μmol/L的6-羥基多巴胺(6-OHDA)處理PC12細胞24 h,構建PD模型。

1.2.3 VD干預濃度篩選 按照1.2.2構建PD模型后,利用不同濃度的1,25(OH)2D3(20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL)處理24 h。收集細胞,CCK-8檢測細胞活力。利用30 mmol/L[11]的鐵死亡激活劑Erastin或者5 mmol/L[12]的Nrf2抑制劑ML385分別處理PC12細胞6 h,按照1.2.2構建PD模型后,再利用不同濃度的1,25(OH)2D3(20、40、80 ng/mL)處理24 h。收集細胞,CCK-8檢測細胞活力。

1.2.4 實驗分組 PC12細胞隨機分成:空白對照組(Control)、6-羥基多巴胺組(6-OHDA)、維生素D組(VD)、鐵死亡激活劑組(Erastin)、鐵死亡激活劑+維生素D組(Erastin+VD)、Nrf2抑制劑組(ML385)、Nrf2抑制劑+維生素D組(ML385+VD);其中Control組細胞正常培養不進行任何處理、6-OHDA組細胞按照1.2.2構建PD模型、VD組按照1.2.2構建PD模型后,利用1,25(OH)2D3(40 ng/mL)處理24 h、Erastin組利用30 mmol/L的Erastin處理PC12細胞6 h后,再按照1.2.2構建PD模型、Erastin+VD組利用30 mmol/L的Erastin處理PC12細胞6 h,構建PD模型,再利用1,25(OH)2D3(40 ng/mL)處理24 h、ML385組利用5 mmol/L的ML385處理PC12細胞6 h后,再按照1.2.2構建PD模型、ML385+VD組利用5 mmol/L的ML385處理PC12細胞6 h,構建PD模型,再利用1,25(OH)2D3(40 ng/mL)處理24 h。

1.2.5 CCK-8(Cell Counting Kit-8)檢測 PC12細胞按照1×104個/孔接種于96孔板,按照1.2.4分組,干預結束后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,并在37℃條件下孵育1 h。利用酶標儀測定其450 nm處的吸光度值(OD value)。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 PC12細胞按照1×105個/孔接種于6孔板,按照1.2.4分組,干預結束后,用預冷PBS離心洗滌,收集1×105～10×105個細胞(包括培養上清中的細胞);取 500 μL 1×Binding Buffer重懸細胞;每管加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI;輕柔渦旋混勻后,室溫避光孵育5 min;流式細胞儀分析,在流式細胞儀上,通過FITC檢測通道檢測Annexin V-FITC(Ex=488 nm; Em=530 nm)和通過PI檢測通道(Ex=535 nm;Em=615 nm)檢測PI。

1.2.7 MDA、LDH、SOD、GSH含量檢測 PC12細胞按照1×105個/孔接種于6孔板,按照1.2.4分組,干預結束后,收集上清和細胞;參考試劑盒說明書檢測MDA、LDH、SOD、GSH含量。

1.2.8 鐵離子含量檢測 PC12細胞按照1×105個/孔接種于6孔板,按照1.2.4分組,干預結束后,收集上清和細胞;參照試劑盒說明書檢測鐵離子含量。

1.2.9 qRT-PCR檢測 PC12細胞按照1×105個/孔接種于6孔板,按照1.2.4分組干預,干預結束后,收集細胞,TRIzon Reagent裂解提取RNA;cDNA合成試劑盒合成cDNA后,qRT-PCR檢測各基因的表達,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其序列如表1,反應程序為94℃,30 sec;(94℃,5 sec)×40個循環;61℃,35 sec。采用2-△△CT法分析目的基因的相對表達量,計算公式如下:△Ct= Ct目的基因-Ct內參,即△△Ct=△Ct樣本-△Ct對照,再計算各組2-△△CT值,即為各組中基因的相對表達量。

表1 引物序列

1.2.10 Western blot檢測 PC12細胞按照1×105個/孔接種于6孔板,按照1.2.4分組,干預結束后,收集細胞,加500 μL RIPA(含1 mmol/L PMSF);冰上裂解細胞,30 min;4℃ 12 000 r/min離心10 min,收集上清;BCA定量后,SDS-PAGE電泳;以兔抗HO-1抗體(1∶500)、兔抗Nrf2 抗體(1∶800)、兔抗XCT抗體(1∶1 000)、兔抗GPX4 抗體(1∶800)、兔抗Transferrin Receptor 抗體(1∶500);兔抗GAPDH抗體(1∶10 000)、兔抗Ferritin-1(1∶1 000)為一抗,4℃孵育過夜;PBS清洗后,HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶2 000)室溫孵育1 h,TBST洗5次,每次10 min;將配好的ECL顯色液加到PVDF膜上進行曝光拍照。Image 2x軟件采集各樣本灰度值,蛋白相對表達量以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示。

2 結果

2.1 維生素D可顯著降低6-OHDA對PC12細胞活力的影響與Control組比較,6-OHDA可顯著抑制PC12細胞活力(t=5.031,P=0.002);與6-OHDA處理組比較,不同濃度的VD均可顯著促進PC12細胞活力(F=33.25,P=0.000),并呈現濃度依賴性;與20 ng/mL的VD相比,40 ng/mL(t=3.796,P=0.009)和80 ng/mL(t=4.607,P=0.004)的VD均可促進PC12細胞活力,見表2。

表2 預處理組細胞活力檢測

與Control組比較,Erastin可顯著抑制PC12細胞活力(t=15.820,P=0.000);與Erastin組比較,不同濃度的VD均可顯著促進PC12細胞活力(F=3.733,P=0.041);20 ng/mL與40 ng/mL的VD對PC12細胞活力的影響相當,與20 ng/mL的VD相比,80 ng/mL的VD可顯著促進PC12細胞活力(t=2.657,P=0.025)。與Control組比較,ML385可顯著抑制PC12細胞活力(t=14.760,P=0.000);與ML385組比較,不同濃度的維生素D均可顯著促進PC12細胞活力(F=24.440,P=0.000),并呈現濃度依賴性;與20 ng/mL的VD相比,40 ng/mL(t=2.556,P=0.043)及80 ng/mL(t=5.216,P=0.013)的VD均可顯著促進PC12細胞活力,見表3。綜上所述,40 ng/mL及80 ng/mL VD均可促進PC12細胞活力,但兩組細胞活力相差不大,結合實驗效益,故后續實驗均選用40 ng/mL的VD進行實驗。

表3 Erastin干預組及ML385干預組細胞活力檢測

2.2 維生素D可顯著抑制6-OHDA所致PC12細胞凋亡與Control組比較,6-OHDA干預后,可顯著促進PC12細胞凋亡(t=22.030,P=0.000);與6-OHDA組比較,維生素D干預后,可顯著抑制PC12細胞凋亡(t=16.570,P=0.000)。與VD組比較,Erastin+VD(t=7.246,P=0.002)、ML385+VD(t=7.260,P=0.002)組細胞凋亡水平顯著升高,見圖1。

注:與Control組比較, **P<0.01; 與6-OHDA組比較, **P<0.01; 與Erastin組比較, △△P<0.01; 與ML385組比較, ∧∧P<0.01; 與VD組比較, &&P<0.01 (柱狀圖從左至右依次為Control組、6-OHDA組、VD組、Erastin組、Erastin+VD組、ML385組、ML385+VD組)。圖1 細胞凋亡檢測

2.3 維生素D可顯著抑制6-OHDA所致PC12細胞氧化應激水平與Control組比較,6-OHDA干預后,PC12細胞中GSH(t=276.400;P=0.000)、SOD(t=76.000;P=0.000)水平均顯著降低,而LDH(t=86.960;P=0.000)、MDA(t=16.040;P=0.000)水平顯著升高。與6-OHDA組比較,VD可顯著提高GSH(t=56.310;P=0.000)、SOD(t=76.330;P=0.000)水平,降低LDH(t=40.790;P=0.000)、MDA(t=9.177;P=0.000)水平。與VD組比較,Erastin+VD組GSH(t=30.260;P=0.000)、SOD(t=26.580;P=0.000)水平均顯著降低,而LDH(t=26.920;P=0.000)、MDA(t=7.746;P=0.001)水平顯著升高;與VD組比較,ML385+VD組等到類似的結果,見表4。

表4 GSH、LDH、MDA、SOD表達檢測

2.4 維生素D可顯著抑制6-OHDA所致PC12細胞鐵離子沉積與Control組比較,6-OHDA干預后,PC12細胞中鐵離子含量顯著升高(t=54.130,P=0.000)。與6-OHDA組比較,VD可顯著抑制PC12細胞中鐵離子沉積(t=27.230,P=0.000)。與VD組比較,Erastin+VD組鐵離子水平顯著升高(t=17.530,P=0.000)。與VD組比較,ML385+VD組鐵離子水平顯著升高(t=6.562,P=0.003),見表5。

表5 鐵離子含量

2.5 維生素D對FTH-1、SLC7A11、GPX4、TFR-1等鐵離子相關標志物表達的影響qRT-PCR檢測分析發現,與Control組比較,6-OHDA干預后,PC12細胞中FTH-1(t=21.470,P=0.000)、SLC7A11(t=89.460,P=0.000)、GPX4(t=80.880,P=0.000)的表達顯著降低,TFR-1的表達顯著升高(t=134.600,P=0.000)。與6-OHDA組比較,VD可顯著提高PC12細胞中FTH-1(t=51.400,P=0.000)、SLC7A11(t=75.850,P=0.000)、GPX4(t=64.660,P=0.000)的表達,TFR-1的表達顯著降低(t=120.200,P=0.000)。與VD組比較,Erastin+VD組FTH-1(t=41.020,P=0.000)、SLC7A11(t=46.570,P=0.000)、GPX4(t=50.440,P=0.000)的表達顯著降低,TFR-1的表達升高(t=56.210,P=0.000);與VD組比較,ML385+VD組得到類似的結果,見圖2。

注:與Control組比較, **P<0.01; 與6-OHDA組比較, ##P<0.01; 與Erastin組比較, △△P<0.01; 與ML385組比較, ∧∧P<0.01; 與VD組比較, &&P<0.01。圖2 qRT-PCR檢測FTH-1、SLC7A11、GPX4、TFR-1的表達

Western blot檢測PC12細胞中FTH-1、SLC7A11、GPX4、TFR-1的蛋白表達統計結果與qRT-PCR檢測結果類似,見圖3。

注:與Control組比較, **P<0.01; 與6-OHDA組比較, ##P<0.01; 與Erastin組比較, △△P<0.01; 與ML385組比較, ∧∧P<0.01; 與VD組比較, &&P<0.01。圖3 Western blot檢測FTH-1、SLC7A11、GPX4、TFR-1的表達

2.6 維生素D對Nrf2/HO-1通路激活的影響與Control組比較,6-OHDA干預后,PC12細胞中Nrf2(t=10.430,P=0.001)、 HO-1(t=12.490,P=0.000)的表達顯著降低。與6-OHDA組比較,VD可顯著提高PC12細胞中Nrf2(t=8.465,P=0.001)、HO-1(t=8.422,P=0.001)的表達。與VD組比較, Erastin+VD組Nrf2(t=5.754,P=0.005)、HO-1(t=5.984,P=0.004)的表達顯著降低。與VD組比較,ML385+VD組Nrf2(t=2.883,P=0.009)、HO-1(t=7.839,P=0.001)的表達顯著降低(P<0.01),見圖4。

注:與Control組比較, **P<0.01; 與6-OHDA組比較, ##P<0.01; 與Erastin組比較, △△P<0.01; 與ML385組比較, ∧∧P<0.01; 與VD組比較, &&P<0.01。圖4 Western blot檢測Nrf2、HO-1的表達

3 討論

帕金森病(PD)屬中老年人常見的神經系統變性疾病,主要由位于基底神經節區域黑質致密部(SNpc)的多巴胺能神經元耗竭引起的[1,13],目前缺乏有效的治療手段。研究發現,抑制鐵死亡可顯著緩解PD進展[14-15]。維生素D可以通過調節神經系統鈣平衡以及影響神經營養因子表達而參與神經系統的代謝,發揮其對PD患者的神經保護作用[5]。本研究發現,維生素D可通過抑制6-OHDA所致PC12細胞鐵死亡,進而抑制細胞損傷,提示維生素D可作為PD潛在的治療手段。

維生素D對神經有潛在保護作用,PD患者的維生素D水平較低,PD患者缺乏維生素D較普遍的現象,與PD患者認知功能密切相關[16-17]。維生素D是一類脂溶性類固醇,可以從飲食中獲得,也可以通過皮膚暴露在紫外線下產生,主要包括維生素D2(ergocalciferol,麥角鈣化醇)和維生素D3(cholecalciferol,膽鈣化醇)[18]。在肝臟,維生素D被雙重羥基化激活,轉化為25-羥基維生素D[25(OH)D],然后在腎臟,通過1-α-羥化酶的作用,成為具有活性的1,25-二羥基維生素D2[1,25(OH)2D2]或D3[1,25(OH)2D3][18]。1,25(OH)2D3可通過抑制一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthases,NOS)的產生而抑制活性氧物質的合成;1,25(OH)2D3也能通過提高γ-谷氨酰轉移酶的含量,增加谷胱甘肽(GSH)表達而激活腦內抗氧化途徑,進而減少對帕金森氏癥患者黑質多巴胺能神經元的氧化損傷,阻止多巴胺能神經元的丟失;1,25(OH)2D3通過影響離子通道(Ca2+、Na+、Mg2+等),緩解神經元細胞線粒體損傷[19];1,25(OH)2D3上調神經營養因子的表達,直接促進多巴胺的釋放或者抑制氧化應激的產生[20]。同時,遺傳因素也可能是導致PD患者VD缺乏的重要因素,PD與VD受體單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism,SNP)和維生素D結合蛋白(Vitamin D Binding Protein,DBP)的關聯在PD中已有相關研究[21]。本研究發現,維生素D干預后,可顯著抑制6-OHDA所引起的PC12細胞凋亡,從細胞水平說明了維生素D可緩解PD損傷。

鐵死亡是一種新型細胞死亡形式,通常在細胞死亡過程中伴有大量的鐵離子蓄積和脂質過氧化。已有多項研究發現鐵死亡與PD進展關系密切[8-9,22]。鐵作為強還原劑,會產生羥基自由基,并引起多巴胺的氧化,這促進了PD中黑質多巴胺神經元的氧化環境的形成[23],因此,鐵穩態的失衡會促發PD。維生素D可有效改善缺血缺氧性腦損傷和神經元線粒體損傷,上調神經元中Nrf2和HO-1的表達,導致GPX4、SOD和GSH水平升高,MDA和ROS含量降低[6]。維生素D可通過抑制腸黏膜中ROS及MDA的累積,增加機體抗氧化能力,提高線粒體ATP酶活性,促進線粒體裂變及聚合平衡,最終降低鐵死亡,抑制順鉑所導致的腸黏膜內皮細胞鐵死亡[24]。不同濃度維生素D處理后,可顯著提高斑馬魚的抗氧化能力,抑制肝細胞的線粒體損傷,增加鐵死亡相關基因(FTH-1、GPX4、GP4a、GPX4b)的表達,最終促進斑馬魚的存活率[25]。本研究發現,6-OHDA刺激后,可促進PC12細胞鐵沉積,GSH、SOD的水平顯著降低,LDH、MDA水平顯著升高;FTH-1、SLC7A11、GPX4、TFR-1的表達顯著降低。而維生素D干預后,GSH、SOD的水平顯著升高,LDH、MDA水平顯著降低;FTH-1、SLC7A11、GPX4、TFR-1的表達顯著升高;鐵死亡激活劑Erastin可顯著抑制維生素D的作用,以上結果說明維生素D緩解6-OHDA所致PC12細胞損傷與鐵死亡相關。

Nrf2/HO-1通路和鐵死亡關系密切[26]。抑制Nrf2后,可顯著抑制氧糖剝奪所致MLE12細胞氧化應激及線粒體功能變化,降低SLC7A11和HO-1的表達,抑制鐵死亡,緩解急性肺損傷[27]。在癲癇模型中,海馬神經元細胞中GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA及蛋白表達水平均顯著降低,促進神經元細胞鐵死亡,而提高GPX4、Nrf2及HO-1的表達,可顯著緩解神經元細胞鐵死亡[28]。有研究發現,維生素D可通過激活Nrf2抑制鐵死亡[6]。本研究發現,利用Nrf2抑制劑ML385干預后,維生素D緩解6-OHDA所致PC12細胞鐵死亡的作用顯著降低,說明維生素D調控6-OHDA所致PC12細胞鐵死亡與Nrf2/HO-1通路激活相關。

綜上所述,本研究初步說明維生素D可激活Nrf2/HO-1通路,緩解6-OHDA所致PC12細胞鐵死亡。但由于本研究局限于細胞水平,后續還需通過動物水平,進一步明確維生素D緩解PD進展與鐵死亡的關系及可能調控機制。