DYRK1A調控NLRP3激活在帕金森病模型中的研究

蔡 倩, 夏 歡, 羅 琴, 楊新玲

(1新疆醫科大學附屬腫瘤醫院, 烏魯木齊 830011; 2新疆神經系統疾病研究重點實驗室, 烏魯木齊 830063; 3新疆醫科大學, 烏魯木齊 830017)

帕金森病(Parkinson′s Disease,PD)是老年人中第二大常見的神經退行性疾病。據估計,PD占65歲以上人口的2%～3%,這給家庭和社會造成了巨大的負擔[1]。盡管尚未闡明PD的確切機制,但越來越多的證據表明,小膠質細胞介導的神經炎癥是大腦老化和包括PD在內的大多數神經退行性疾病的共同特征[2-3]。小膠質細胞是中樞神經系統(Central nervous system,CNS)的先天免疫細胞,在維持大腦穩態方面發揮著重要作用[4]。然而,小膠質細胞的持續過度激活會誘發慢性神經炎癥反應,在帕金森病(PD)的神經炎癥和神經變性中起著至關重要的作用,其中小膠質細胞富含的NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎癥小體可能作為PD治療的潛在靶點[5]。NLRP3是其中核心蛋白之一,它的激活啟動炎癥小體的形成。

雙特異性酪氨酸調控激酶1A(Dual specificity tyrosine-regulated kinase1a,DYRK1A)是一種蛋白激酶,在中腦黑質、紋狀體及海馬中表達豐富,對中腦多巴胺(Dopamine,DA)神經元發育及其生理功能至關重要。全基因組關聯研究(GWAS)的薈萃分析顯示DYRK1A是PD的一個危險因素[6]。本研究擬分析DYRK1A在帕金森病神經炎癥中的作用,在MPP+(1-methyl-4-phenylpyridinium,1-甲基-4-苯基吡啶離子)/MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶)誘導的PD細胞及動物模型上分析DYRK1A與NLRP3蛋白的關系,探討可能的機制,為帕金森病的發病機制提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及實驗動物 實驗所用BV2細胞(小鼠小膠質細胞)購自上海雅吉生物科技有限公司。6～8周齡的雄性C57BL/6小鼠采購于廣東藥康生物科技有限公司,體重(20±1.24)g,共40只。所有的實驗操作流程均符合中國動物研究協會規定,遵從倫理委員會的動物實驗倫理要求。

1.1.2 試劑 MPP+(美國Sigma公司)、MPTP(美國Sigma公司)、Harmine(美國Abcam公司)、兔抗NLRP3(ABclonal)、小鼠抗Dyrk1a(美國Santa cruz公司)、小鼠抗β-actin(美國Santa cruz公司)、Alexa Fluor 555山羊抗小鼠二抗(美國Cell Signaling Technology公司)、Alexa Fluor 488山羊抗兔二抗(美國Cell Signaling Technology公司)、HRP標記的抗兔二抗(美國Thermo Scientific公司)、HRP標記的抗小鼠二抗(美國Thermo Scientific公司)。

1.1.3 主要儀器 細胞培養箱(美國Thermo Scientific公司)、全波長酶標儀(美國Thermo Scientific公司)、化學發光成像儀(英國Syngene公司)、正置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)、臺式低速離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 DYRK1A抑制劑Harmine處理PD細胞模型 培養BV2細胞,培養條件如下:37℃、5%CO2、高糖DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)和5%胎牛血清(FBS,Invitrogen)。提前24 h將BV2細胞接種于10 cm細胞培養皿中,約1×106個/皿,密度達80%～90%后,將配好的MPP+母液(10 mmol/L)解凍后,用完全培養基稀釋為不同濃度(MPP+為0、50、75、100和125 μmol/L)處理BV2細胞,培養24 h后收集細胞做后續實驗。選不同濃度的Harmine(0、5、10和15 μmol/L)處理BV2細胞(同時加入MPP+或者不加入MPP+)。

1.2.2 DYRK1A抑制劑Harmine處理PD慢性動物模型 40只雄性C57BL/6小鼠隨機分為5組[7],分別為對照組(DMSO組)、模型組(DMSO+MPTP組)、模型低濃度抑制劑(10 mg/kg)組(DMSO+H1+MPTP組)、模型中濃度抑制劑(20 mg/kg)組(DMSO+H2+MPTP 組)、模型高濃度抑制劑(30 mg/kg)組(DMSO+H3+MPTP 組),每組8只。除對照組外,剩余4組小鼠給予腹腔注射MPTP,25 mg/kg,每周2次,連續注射5周構建PD慢性動物模型[8]。3組抑制劑組還需間隔給予腹腔注射低、中、高濃度的Harmine,共5周。

1.2.3 CCK8法檢測細胞活性 細胞計數后,計算所鋪細胞的孔的數量,在96孔板中每孔加入100 μL含有4 000個細胞的細胞懸液,在細胞培養箱中培養24 h;分別加入不同濃度MPP+,每個濃度設置3個復孔,細胞培養箱孵育24 h;每孔加入10 μL CCK8溶液,避光,在細胞培養箱內繼續孵育2 h;在酶標儀上測定吸光度,波長為450 nm。吸光度值減去培養基的陰性對照即為相應的OD值,統計分析各個濃度的OD值。

1.2.4 免疫印跡 BV2小膠質細胞在裂解液中裂解,12 000 r/min離心15 min。參考BSA標準溶液定量上清液中的蛋白質濃度。將10 μg蛋白質上樣到10% SDS凝膠上進行電泳分離,并轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。膜在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h,然后在4℃下與一抗(鼠抗Dyrk1a,1∶500;兔抗NLRP3,1∶500)搖床過夜。最后,將膜與二抗(抗小鼠二抗1∶5 000;抗兔二抗1∶5 000)孵育2 h,加用ECL發光液,在化學發光成像儀下檢測,獲取和分析圖像。

1.2.5 免疫組織熒光染色 取出冰凍切片,置于室溫復溫,將所需腦片貼在載玻片上,做好標記,晾干;置于37℃恒溫箱內烘干;PBS水化,倒出PBS,將腦片浸泡在枸櫞酸修復液中,微波爐修復;梯度冷卻,PBS洗3次,0.3%Triton X-100破膜,PBS洗3次;腦片上滴加即用型山羊血清封閉液,室溫封閉1 h;棄去封閉液,加一抗(小鼠抗GFAP,1∶1 000;兔抗IBA1,1∶1 000),4℃過夜;第二日,室溫復溫,PBS清洗3次;加熒光二抗(Alexa Fluor 555山羊抗小鼠二抗,Alexa Fluor 488山羊抗兔二抗,均為1∶1 000),室溫避光孵育1 h;PBS洗3次;在腦片上滴加含DAPI的封片劑,將蓋玻片蓋在腦片上,正置熒光顯微鏡下避光觀察拍照。

2 結果

2.1 不同濃度MPP+處理BV2細胞后DYRK1A及NLRP3蛋白的表達當MPP+濃度分別為50、75和100 μmol/L時,NLRP3蛋白表達水平較MPP+濃度為0時明顯增高,差異有統計學意義(P<0.05);當MPP+濃度分別為50、75和125 μmol/L時,DYRK1A蛋白表達水平較MPP+濃度為0時明顯增高,差異有統計學意義(P<0.05)(圖1)。

注: (A-C)不同濃度的MPP+處理BV2細胞24 h后, WB檢測DYRK1A及NLRP3蛋白表達; 與0 μmol/L MPP+相比, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。圖1 不同濃度MPP+處理BV2細胞后DYRK1A及NLRP3蛋白的表達

2.2 抑制DYRK1A后可減輕MPP+對BV2的損傷及NLRP3的激活

2.2.1 DYRK1A抑制劑改善MPP+損傷的BV2細胞活性 選用MPP+50 μmol/L的濃度干預BV2細胞24 h,產生毒性作用,細胞的活性下降;同時分別以0、5、10、15 μmol/L不同濃度的DYRK1A抑制劑(Harmine)處理24 h后,相比MPP+組,Harmine+MPP+組BV2細胞的活性增加,其中濃度為10、15 μmol/L時,分別為74%、78%,有統計學差異(P<0.05)(圖2A)。相比MPP+組,Harmine+MPP+組細胞培養基隨著Harmine濃度的升高,由黃色逐漸變為紅色(圖2B)。

注:(A)不同濃度的Harmine處理MPP+干預的BV2細胞24 h后,隨著Harmine濃度的升高,BV2細胞活性呈濃度依賴性升高;(B)不同濃度Harmine處理MPP+干預的BV2細胞24 h,培養基顏色的變化情況,與MPP+組比較, ***P<0.001。圖2 不同濃度Harmine對MPP+損傷的BV2細胞活性的影響

2.2.2 抑制DYRK1A后可減輕MPP+誘發的NLRP3激活 與0 μmol/L MPP+比較,50 μmol/L MPP+處理小膠質細胞后,NLRP3蛋白表達水平增加;選用10 μmol/L濃度的DYRK1A抑制劑(Harmine)及50 μmol/L的MPP+同時處理小膠質細胞時,NLRP3蛋白的表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.05),提示DYRK1A抑制劑可減輕MPP+誘發的NLRP3蛋白激活(圖3)。

注:(A-B)使用DYRK1A抑制劑處理MPP+誘導的小膠質細胞,分為對照MPP+(0 μmol/L)組(0)、MPP+(50 μmol/L)組(M)、Harmine(10 μmol/L)組(H)、Harmine(10 μmol/L)+MPP+(50 μmol/L)組(H+M),WB檢測NLRP3蛋白的表達;與MPP+(50 μmol/L)組(M)比較, **P<0.01。圖3 DYRK1A抑制劑處理MPP+誘導的小膠質細胞中NLRP3蛋白的表達

2.3 DYRK1A抑制劑可減少MPTP慢性PD小鼠模型中腦黑質的小膠質細胞數量免疫組織熒光結果顯示,與對照組(DMSO組)相比,模型組(DMSO+MPTP組)小鼠中腦黑質的小膠質細胞數量增多;與模型組(DMSO+MPTP組)相比,模型中濃度抑制劑(20 mg/kg)組(DMSO+H2+MPTP組)小鼠中腦黑質的小膠質細胞數量減少(圖4)。

注:從左到右,標尺依次為500 μm、 100 μm、 50 μm, n=3。圖4 各組小鼠黑質區小膠質細胞數量比較

2.4 抑制DYRK1A后可減輕MPTP小鼠中腦黑質區NLRP3的激活與對照組(DMSO組)比較,模型組(DMSO+MPTP組)小鼠中腦黑質中的NLRP3蛋白表達明顯升高;與模型組(DMSO+MPTP組)比較,不同濃度抑制劑組小鼠中腦黑質中NLRP3蛋白表達均有下降。其中,模型中濃度及高濃度抑制劑組(DMSO+H2+MPTP、DMSO+H3+MPTP)下降明顯(P<0.05)(圖5)。與MPP+誘導的PD細胞模型中DYRK1A蛋白升高結果一致。

注:(A-B)使用不同濃度DYRK1A抑制劑處理MPTP小鼠模型,WB檢測NLRP3蛋白的表達;與DMSO+MPTP組比較, *P<0.05, n=5。圖5 DYRK1A抑制劑處理MPTP小鼠中腦黑質區NLRP3蛋白的表達

3 討論

神經炎癥是導致PD發生和發展的關鍵因素之一[9],研究表明小膠質細胞介導的神經炎癥在帕金森病的致病過程中起著關鍵作用[10-11]。作為大腦的主要免疫細胞,小膠質細胞是神經炎癥過程中的主要細胞介質,它的激活在神經退行性過程中至關重要[12-13]。其中小膠質細胞NLRP3炎性小體的激活和小膠質細胞釋放促炎細胞因子可促進PD進展,受損的DA神經元可直接導致小膠質細胞激活,產生大量促炎細胞因子(IL-1β、IL-18)[14],而持續存在的小膠質細胞介導的神經炎癥又可導致帕金森病(PD)中多巴胺能(DA)神經元的進行性丟失。

小膠質細胞NLRP3可能是神經炎癥的持續來源,可以推動DA神經元病理學進行性改變,成為PD疾病緩解治療的一個潛在靶點[15]。本研究在使用MPP+處理小膠質細胞后發現NLRP3蛋白升高,其中在50 μmol/L濃度時升高最明顯,提示神經毒素MPP+在啟動NLRP3激活中可能有作用。與本研究一致的觀點,Lee等[11]的研究顯示,在原代小膠質細胞和混合神經膠質細胞培養物中,MPTP/ATP處理通過產生線粒體活性氧促進NLRP3炎性體的穩健組裝和激活。MPP+在小鼠骨髓來源的巨噬細胞中,在ATP或尼日利亞菌素處理存在的情況下誘導NLRP3炎性體激活。Qiao等[16]的研究顯示,下調NLRP3蛋白表達并抑制小鼠肝臟中NLRP3炎性體的激活,減輕了MPTP觸發的小膠質細胞激活和中腦DA神經元丟失[16]。目前已有不少使用該靶點進行相關藥物研究的報道[17-19]。

DYRK1A是一種參與神經細胞增殖和細胞死亡的多效性激酶,在調節大腦生理功能和病理過程中起著關鍵作用。本課題組既往研究發現不同認知功能障礙的帕金森病患者血漿DYRK1A水平有差異,提示血漿DYRK1A水平可能與帕金森病患者的認知功能有關[20]。本研究在細胞模型上發現DYRK1A與NLRP3炎癥小體有關。在MPP+處理小膠質細胞后,DYRK1A與NLRP3蛋白表達水平均有所升高;使用DYRK1A抑制劑Harmine后,NLRP3蛋白下調。考慮抑制DYRK1A可減輕MPP+誘導的帕金森病模型中NLRP3炎癥小體激活,從而減少神經元丟失,起到神經保護作用。相似的研究,Ju等[21]的研究結果顯示,脂多糖(LPS)誘導的永生化小鼠BV2小膠質細胞系中,DYRK1A激酶的表達和活性均因炎癥而增加;使用 Harmine或siRNA沉默抑制DYRK1A可顯著減少LPS刺激的BV2細胞中促炎因子的產生。Araldi等[22]的研究顯示,一種DYRK1A/B酶抑制劑,新型含氟多酚衍生物(1c)在脂多糖(LPS)誘導的炎癥模型和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶 (MPTP)帕金森病動物模型這兩種體內模型中表現出優異的活性。

綜上,NLRP3炎性小體激活在PD的神經炎癥中起關鍵作用,本研究結果表明抑制DYRK1A可能抑制NLRP3的激活,為帕金森病的治療提供靶點。然而,盡管抑制NLRP3炎癥小體激活已被證明在PD模型中具有治療作用,但這些潛在藥物的安全性和有效性仍需要在PD患者的臨床試驗中得到證實,應該加快基礎研究向臨床應用的轉化進程,以實現PD的新治療策略。