固態發酵改善棉籽粕品質的研究

鄒峰余 賈冰玉 鄭 華 趙述淼 羅 智 劉志博 柯 江 譚肖英

(1.華中農業大學水產學院, 武漢 430070; 2.華中農業大學生命科學技術學院, 武漢 430070)

棉籽粕(Cottonseed meal, CSM)是水產飼料中替代魚粉的重要蛋白源之一[1], 具有產量穩定、蛋白質含量高、氨基酸組成較為平衡等優點。然而,棉籽粕中高水平的游離棉酚(Free gossypol, FG)限制了其在飼料行業的應用。游離棉酚會影響生物機體內酶的功能, 改變細胞膜的通透性[2], 并且會影響生物機體對礦物質元素和蛋白質的消化吸收[3],一旦攝入量過大, 會對生物體產生不可逆的傷害。此外, 還存在如植酸、單寧等抗營養因子, 同樣會對生物體的營養利用及健康造成損害[4,5]。

目前已經開發了多種方法來降解棉籽粕中的游離棉酚, 例如使用有機溶劑, 如丙酮和乙醇, 可以從棉籽粕中提取游離棉酚, 從而減少游離棉酚含量[6]。然而, 此方法會造成棉籽粕中蛋白質溶失, 降低蛋白質質量。此外, 促使游離棉酚與其他化合物的結合也是有效方法, 如FeSO4或Ca(OH)2[7], 然而, 用FeSO4等化合物結合游離棉酚會導致飼料顏色及其他性狀的變化, 并且會降低棉籽粕的適口性和營養物質的含量。

固態發酵被認為是降解棉籽粕中游離棉酚及其他抗營養因子含量的最有效方法之一。此外,發酵過程中的代謝活動可能會產生一些酶、維生素和一些其他未知的有益物質, 提高棉籽粕的營養價值[8], 這些物質往往會對機體的生長和健康產生有利效果, 從而擴大了棉籽粕在水產養殖業中的應用。芽孢桿菌可以有效降解游離棉酚, 然而一些芽孢桿菌在氨基酸代謝過程中會發生脫羧基或脫氨基作用, 產生刺激性的氨, 影響發酵的風味, 而乳酸菌和酵母菌在厭氧發酵過程中會產生有機酸、醇類物質等, 能夠提升棉籽粕的品質及風味[9—11]。基于此, 本研究首先以抗營養因子降解能力為指標, 篩選出降解能力強的枯草芽孢桿菌, 并使用單因素試驗法對其發酵條件進行優化,隨后在此優化結果基礎上, 采用枯草芽孢桿菌配合釀酒酵母、植物乳桿菌, 并且加入纖維素酶、植酸酶輔助發酵棉籽粕, 對混菌發酵的菌液接種比例及酶添加量進行優化, 隨后對其發酵效果進行評價。

1 材料與方法

1.1 實驗菌種

枯草芽孢桿菌購自中國典型培養物保藏中心;釀酒酵母和植物乳桿菌均由華中農業大學生命科學技術學院發酵與酶工程教研室惠贈。

1.2 實驗試劑

牛肉膏、氯化鈀、鎢酸鈉-磷鉬酸和植酸鈉(上海麥克林生化科技有限公司); 酚酞和單寧酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司); 植酸酶(10000 U/g,武漢新華揚生物公司); 纖維素酶(50000 U/g, 上海源葉生物科技有限公司); 其他化學試劑均為分析純, 購自上海國藥。

LB培養基(100 mL, 枯草芽孢桿菌用): 蛋白胨1 g, 酵母粉0.5 g, 氯化鈉0.5 g, 121℃滅菌20min。

MRS培養基(100 mL, 植物乳桿菌用): 蛋白胨1 g, 牛肉膏1 g, 酵母粉0.5 g, 葡萄糖2 g, 無水醋酸鈉0.5 g, 檸檬酸二銨0.2 g, 吐溫-80 0.1 mL, 硫酸鎂0.058 g, 硫酸錳0.025 g, 121℃滅菌20min。

YPD培養基(100 mL, 釀酒酵母用): 酵母粉l g,蛋白胨2 g, 葡萄糖2 g, 121℃滅菌20min。

固體培養基為上述液體培養基中加1.5—2.0 g的瓊脂。

棉籽粕固態發酵培養基: 棉籽粕經粉碎過60目篩, 稱取適量后置于250 mL錐形瓶中, 121℃滅菌20min, 備用。

1.3 菌株的擴大培養

使用接種環將保藏在斜面上的單一菌種刮取2—3環, 接種于對應培養基中, 枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌培養溫度為37℃, 釀酒酵母培養溫度為30℃, 振蕩培養24h, 為一級種子液。再以一級種子液的5%接種于250 mL錐形瓶中, 振蕩培養24h, 置于4℃冰箱備用。

固態發酵枯草芽孢桿菌單菌固態發酵: 將棉籽粕用粉碎機粉碎后過60目篩, 120℃高壓滅菌20min, 分別以接種量(5%、8%、11%和14%), 水料比(0.4∶1、0.6∶1、0.8∶1和1∶1), 發酵時間(36h、48h、60h和72h)為變量進行單因素實驗, 加入二級種子液以及滅菌水, 于500 mL錐形瓶中攪拌均勻, 放入恒溫振蕩培養箱中, 以37℃進行固態發酵, 其中每組3個平行, 并且設置不接種任何菌株的空白料作為對照。

混菌發酵將枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和植物乳桿菌分別以菌液體積比例1∶1∶1、2∶1∶1、1∶2∶1和1∶1∶2(其中1=3%、2=6%)接種于棉籽粕中,添加滅菌水使得初始水分含量為60%, 放入恒溫振蕩培養箱中, 發酵溫度37℃, 先好氧發酵48h (采用3層透氣膜封口, 保持物料蓬松, 每12h攪拌1次), 再厭氧發酵(三層透氣膜加一層保鮮膜封口, 將物料壓實, 且不攪拌) 48h, 其中每組3個平行, 并且設置不接種任何菌株的空白料作為對照。在發酵完成后, 收集發酵原料, 55℃烘干24h, 粉碎機粉碎至過40目篩, 放至-20℃保存, 用于后續分析檢測。

參照最優菌種比例將菌液接種于棉籽粕固態發酵培養基, 分別添加纖維素酶(0、0.50%、1.25%和2.00%)或植酸酶(0.00%、0.03%、0.10%和0.33%)至發酵培養基, 放入恒溫振蕩培養箱中, 發酵溫度37℃, 先好氧發酵48h (采用3層透氣膜封口, 保持物料蓬松, 每12h攪拌1次), 再厭氧發酵(三層透氣膜加一層保鮮膜封口, 將物料壓實, 且不攪拌) 48h, 其中每組3個平行, 并且設置不接種任何菌株的空白料作為對照。在發酵完成后, 收集發酵原料, 55℃烘干24h, 粉碎機粉碎至過40目篩, 放至-20℃保存, 用于后續分析檢測。

根據前期實驗結果, 設置接種菌液體積為枯草芽孢桿菌(3%)∶釀酒酵母(3%)∶植物乳桿菌(6%)=1∶1∶2, 其中各菌種的活菌數為枯草芽孢桿菌(2.08×108CFU/mL)、釀酒酵母(1.25×107CFU/mL)、植物乳桿菌(1.36×108CFU/mL)。添加滅菌水使得初始水分含量為60%, 植酸酶添加量為0.1%, 纖維素酶添加量1.25%, 放入恒溫振蕩培養箱中, 發酵溫度37℃。先好氧發酵48h (采用3層透氣膜封口, 保持物料蓬松, 每12h攪拌1次), 再厭氧發酵(三層透氣膜加一層保鮮膜封口, 將物料壓實, 且不攪拌) 48h, 其中每組3個平行, 并且設置不接種任何菌株的空白料作為對照。在發酵完成后, 收集發酵原料, 55℃烘干24h, 粉碎機粉碎至過40目篩, 放至-20℃保存,用于后續分析檢測。

1.4 測定指標及方法

感官評價發酵結束后每組抽取3個樣品,按照羅遠琴等[10]的方法進行感官評價。

游離棉酚含量檢測采用國標法(GB/T 13086-2020)檢測, 大致步驟如下: ①精確稱取適量樣品于250 mL具塞錐形瓶中, 加入玻璃珠, 準確加入50 mL試劑A(6∶4異丙醇-正己烷混合溶液500 mL,加入2 mL氨基丙醇, 8 mL冰醋酸, 50 mL水, 再用異丙醇-正己烷混合溶液定容至1000 mL), 室溫下振蕩提取3h, 用濾紙過濾, 獲得濾液為待測樣品。②移液管取雙等份濾液10 mL于25 mL棕色容量瓶a、b中, 取雙等份溶劑A 10 mL于25 mL容量瓶中a0、b0, 用混合溶液定容a、a0至刻度做參比溶液, 向b、b0中加入2 mL苯胺, 沸水浴30min, 冷卻至室溫后,用混合溶液定容至刻度。用酶標儀測定各吸光值,隨后根據國標法中計算公式計算。

單寧含量檢測采用國標法(GB/T 27985-2011)檢測, 大致步驟如下: ①準確稱取適量樣品1—2 g, 精確加入1∶1丙酮水溶液50 mL, 振蕩提取2h, 濾紙過濾, 濾液為待測樣品。②精確量取試樣1 mL, 加入含有約30 mL蒸餾水的50 mL容量瓶中,加入鎢酸鈉-磷鉬酸溶液2.5 mL, 碳酸鈉溶液5 mL,定容至刻度, 搖勻, 放置顯色30min, 760 nm處測吸光度后代入標曲計算濃度。根據國標法中計算公式計算樣品中單寧酸含量。

植酸含量檢測采用改良WADE法[12]進行。WADE試劑: 稱取1.5 g三氯化鐵(0.03%)、15 g磺基水楊酸(0.3%)。加水溶解并定容至500 mL, 使用前用水稀釋10倍。0.2 mg/mL植酸標準溶液配置:1.8889 g植酸鈉標準品, 先加蒸餾水溶解并定容至100 mL, 使用前吸取5 mL, 定容至500 mL。植酸標準曲線的制作: 精確吸取0.2 mg/mL的植酸標準使用液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL于7支試管中, 用蒸餾水補足至5 mL, 吸取1 mL WADE試劑混合, 10℃, 1000 rpm離心10min。取200 μL, 500 nm處讀取吸光值, 以吸光度為縱坐標, 植酸含量為橫坐標, 制作標準曲線。

采用凱氏定氮法(K9860全自動凱氏定氮儀)測定樣品的總氮含量, 操作步驟及計算公式參照GB/T 6432-2018《飼料中粗蛋白的測定凱氏定氮法》。

總酸含量參照蔡國林等[13]的方法進行測定, 結果用乳酸含量計。

酸溶蛋白含量根據NY/T 3801-2020《飼料原料中酸溶蛋白的測定》方法測定: 稱取2 g發酵樣品于50 mL離心管中, 加入20%三氯乙酸溶液40 mL,搖床 150 r/min振蕩30min, 靜置5min后, 4000 r/min離心5min。取10 mL濾液加入消化管中, 加入催化劑, 按照粗蛋白質含量測定方法進行測定。

1.5 統計分析

采用SPSS 17.0軟件對實驗數據進行統計分析,所有數據結果均用平均值±標準誤(mean±SE,n=3)表示。使用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行不同組間指標差異性統計檢驗, 若不同組間的差異顯著, 則采用Duncan多重比較來檢驗不同處理組間的差異顯著性, 以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 發酵條件對枯草芽孢桿菌發酵效果的影響

由圖1可知, 當使用枯草芽孢桿菌對棉籽粕進行單菌發酵時, 其接種量為11%時, 游離棉酚、植酸及單寧的降解效果均高于其他組。

由圖2可知, 當使用枯草芽孢桿菌對棉籽粕進行單菌發酵時, 當蒸餾水添加量和底物比例為0.8∶1時, 對游離棉酚的降解效果均高于其他組, 而當比例為0.6∶1時, 對棉籽粕中單寧和植酸的降解效果均高于其他組。

圖2 水料比對枯草芽孢桿菌發酵棉籽粕中抗營養因子含量的影響Fig.2 Effect of water-to-material ratio on antinutritional factor content in Bacillus subtilis fermented cottonseed meal

由圖3可知, 當使用枯草芽孢桿菌對棉籽粕進行單菌發酵60h之后, 游離棉酚、植酸及單寧的降解效果均顯著高于前三組而與后一組無顯著性差異。

圖3 發酵時間對枯草芽孢桿菌發酵棉籽粕中抗營養因子含量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on antinutritional factor content in Bacillus subtilis fermented cottonseed meal

2.2 混菌比例對固態發酵效果影響

如圖4所示, 當枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、植物乳桿菌的接種比例為1∶1∶2時, 固態發酵棉籽粕的植酸和單寧含量均低于其他組, 而總酸含量均高于其他組。綜合考慮, 枯草芽孢桿菌、釀酒酵母及植物乳桿菌的比例選取1∶1∶2時發酵效果較好, 此時, 棉籽粕的抗營養因子得到有效降解, 總酸含量得到顯著提高。

圖4 枯草芽孢桿菌、釀酒酵母及植物乳桿菌比例對固態發酵棉籽粕中抗營養因子及總酸含量的影響Fig.4 Effect of ratio of Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae and Lactobacillus plantarum on antinutritional factor content and total acid content in fermented cottonseed meal

2.3 纖維素酶添加比例對混菌發酵棉籽粕抗營養因子含量影響

由圖5可知, 纖維素酶添加對混菌固態發酵棉籽粕的植酸及單寧含量沒有影響, 而能夠進一步顯著降低游離棉酚含量, 且當纖維素酶添加比例為1.25%時, 游離棉酚含量顯著低于前三組而與第五組沒有顯著差異。

圖5 纖維素酶對混菌固態發酵棉籽粕中抗營養因子含量的影響Fig.5 Effect of cellulase on antinutritional factor content in fermented cottonseed meal

2.4 植酸酶添加比例對混菌發酵棉籽粕抗營養因子含量影響

由圖6可知, 植酸酶添加對混菌固態發酵棉籽粕的單寧含量沒有影響, 而能夠進一步顯著降低游離棉酚和植酸含量。且當植酸酶添加比例為0.03%時, 游離棉酚含量顯著低于前兩組而與后兩組無顯著性差異, 添加比例為0.1%時, 植酸含量顯著低于前三組而與后一組無顯著性差異。

圖6 植酸酶對混菌固態發酵棉籽粕中抗營養因子含量的影響Fig.6 Effect of phytase on antinutritional factor content in fermented cottonseed meal

2.5 混菌發酵感官評測

由表1可知使用混菌發酵后, 棉籽粕的質地和氣味都有改善, 并且在感官評價上要優于枯草芽孢桿菌單菌發酵。

表1 單菌和混菌發酵棉籽粕感官評價對比Tab.1 Comparison of sensory evaluation of single bacteria and mixed bacteria fermented cottonseed meal

2.6 混菌發酵后棉籽粕中抗營養物質、粗蛋白、酸溶蛋白、總酸含量測定

由表2可知, 發酵后棉籽粕中的抗營養物質顯著降低, 其中游離棉酚降解率達到40.13%, 植酸降解率達到34.92%, 單寧降解率達到40.24。此外, 粗蛋白, 酸溶蛋白, 總酸含量顯著上升, 分別提高了10.26%、59.20%和79.49%。

表2 混菌發酵棉籽粕各成分變化(風干物質)Tab.2 The change of the component in mixed bacteria fermented cottonseed meal (air-dry matter)

3 討論

枯草芽孢桿菌是美國食品藥品管理局認證的無害菌種, 是目前工業生產中使用最普遍的一種菌[14,15]。有研究人員對一株產植酸酶枯草芽孢桿菌發酵棉籽粕的工藝進行優化, 結果表明最佳發酵條件: 溫度37℃, 時間周期72h, 底物初水分30%, 初始pH 7.0, 接種量為7%[16]。Zhang等[17]通過單因素試驗獲得枯草芽孢桿菌對棉籽粕的最佳發酵條件為: 發酵時間72h, 發酵溫度39℃, 初始pH 6.5, 初始含水量50%, 接種量1.0×107CFU/g。對一株高效降解棉酚的芽孢桿菌誘變菌株進行參數優化發現: 物料含水量控制在45%—50%, 菌劑使用量為1.0×1010CFU/kg, 發酵時間13—15d為最佳發酵條件[18]。而在本研究中通過單因素實驗確定枯草芽孢桿菌單菌發酵最佳條件為接種量為11%, 最佳水料比為(0.6—0.8∶1), 最佳發酵時間60h, 不同種的枯草芽孢桿菌的最佳發酵條件不同, 這種差異可能是由物種本身的生物多樣性造成, 也有可能是因為底料的差異所導致。

感官性狀是評價棉籽粕應用效果的最直接指標。我們在使用枯草芽孢桿菌單菌發酵過程中發現, 發酵之后棉籽粕常常結塊嚴重, 在烘干之后, 硬度增加, 不利于粉碎, 并且散發出刺鼻的酸腐味, 這些性狀的變化都不利于發酵棉籽粕的應用, 并且其對植酸的降解效果不理想。有研究人員利用多種酵母菌分別對棉籽粕進行發酵, 發現其發酵產物均具有酒香味[19]。此外, 許多研究者發現, 采用酵母菌、乳酸菌和芽孢桿菌進行復合發酵, 能夠有效的改善棉籽粕的感官性狀, 提升其風味[9—11], 并且乳酸菌發酵還有提升飼料適口性及消化率等功效[20,21]。因此, 我們使用釀酒酵母、植物乳桿菌與枯草芽孢桿菌混合, 并在物料中初始添加植酸酶及纖維素酶溶液, 隨后采用好氧-厭氧分步發酵棉籽粕, 發現混菌發酵相比于單菌發酵顯著提升了棉籽粕的感官評價指標。這可能是因為酵母菌和乳酸菌在厭氧發酵過程中產生了醇類物質及有機酸等[22,23], 提升了發酵棉籽粕的風味。此外, 還發現植酸降解效果的提升, 說明發酵前添加植酸酶溶液, 酶的水解作用與微生物發酵過程能夠協同進行。

在發酵植物原料的實際操作過程中, 微生物自身產生的酶可能量不足或者活性不夠, 因此在對某些大分子物質的水解過程當中并不能產生很好的效果。而單獨的酶解過程并不能產生有益的微生物代謝物, 如檸檬酸、草酸和乳酸可分別由黑曲霉、米曲霉和乳酸桿菌分泌[24]。因此菌酶協同發酵結合了單獨微生物發酵或酶解發酵的優點, 不僅能顯著分解植物原料中的大分子物質, 而且能得到有機酸等有益的微生物代謝產物, 具有很高的實際生產價值。由于單胃動物消化系統中沒有粗纖維降解相關酶, 過量粗纖維不僅會增加動物飽腹感,降低攝食量, 還會降低飼料轉化率[25]。棉籽粕中含有大量的粗纖維, 添加纖維素酶通過破壞植物細胞壁降解棉籽粕中的粗纖維, 可以增加棉籽粕的利用率[26]。本研究發現, 添加纖維素酶能進一步降低混菌發酵棉籽粕中游離棉酚的含量, 可能原因是其對粗纖維的降解提升了微生物對棉籽粕中碳水化合物的利用率從而促進其生長代謝。植酸能和金屬陽離子或蛋白質發生螯合作用, 從而降低礦物質的生物效能, 影響水解酶的活性, 降低蛋白質的利用率并影響動物的消化吸收功能[27]。在單獨微生物發酵中, 我們發現植酸的降解效率不高, 因此在發酵底物中添加植酸酶。結果表明植酸酶能顯著降低棉籽粕中的植酸含量, 并進一步提升對游離棉酚的降解效果, 說明植酸酶的水解作用能夠與微生物的發酵過程協同進行, 在有效水解植酸的同時能進一步提升微生物的繁殖及代謝活動。

隨后我們分析了混菌發酵的抗營養因子降解率以及粗蛋白、酸溶蛋白、總酸含量。發現游離棉酚、植酸和單寧的降解率分別達到了40.13%、34.92%和40.24%, 粗蛋白、酸溶蛋白和總酸含量分別提升了10.26%、59.2%和79.49%。其中, 酸溶蛋白是反映發酵底物中小肽和游離氨基酸含量的重要指標[28], 而發酵過程中乳酸菌產生的乳酸等有機酸, 通常能起到抑制有害微生物生長、促進有益微生物生長的作用。宣秋希等[29]用釀酒酵母、植物乳桿菌、芽孢桿菌進行厭氧-好氧分步發酵, 結果表明, 游離棉酚降解了66.28%、粗蛋白提升了6.38%、酸溶蛋白提升了88.30、L-乳酸的含量從0.01提升到了1.83 g/L。亓秀曄等[9]用植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌進行好氧-厭氧分步發酵棉籽粕,顯著降低了棉籽粕游離棉酚含量、顯著提升了酸溶蛋白含量。此外, 羅遠琴等[10]使用枯草芽孢桿菌和釀酒酵母對棉籽粕進行混菌發酵, 顯著提升了棉籽粕的酸溶蛋白及棉籽肽含量, 以上這些研究結果都與本研究得到類似的結果。綜上, 使用枯草芽孢桿菌、釀酒酵母及植物乳桿菌混菌發酵不僅能有效降解棉籽粕中的抗營養因子含量, 同時能提高其營養價值。并且相比于枯草芽孢桿菌單菌發酵, 配合釀酒酵母以及植物乳桿菌能提升發酵棉籽粕的感官指標及其風味, 此外, 在底物中添加外源性纖維素酶以及植酸酶能進一步提升發酵效果, 從而提升其應用價值。

4 結論

本研究探究了枯草芽孢桿菌單菌發酵棉籽粕降解抗營養物質含量的最佳條件, 同時測評了枯草芽孢桿菌配合釀酒酵母、植物乳桿菌及添加纖維素酶及植酸酶溶液進行混菌發酵的效果。結果表明, 混菌加酶發酵能有效降低棉籽粕抗營養因子含量, 提升營養價值, 并提升其風味, 從而提升其應用價值, 為生產實際提供了一定的理論基礎。