西沙群島鸚嘴魚科耳石形態學物種鑒定的可行性研究

康志鵬 李純厚 李純然 王 騰 * 趙金發 石 娟 劉 永 *

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所, 農業農村部南海漁業資源開發利用重點實驗室, 廣東珠江口生態系統野外科學觀測研究站, 廣東省漁業生態環境重點實驗室, 廣州 510300; 2.西沙島礁漁業生態系統海南省野外科學觀測研究站/海南省深遠海漁業資源高效利用與加工重點實驗室/三亞熱帶水產研究院, 三亞 572018; 3.華中農業大學, 武漢 430070)

耳石是存在于魚類內耳中的鈣質沉積體, 主要礦物成分是碳酸鈣, 分為矢耳石(Sagittae)、微耳石(Lapillus)和星耳石(Asteriscus)共3對[1]。耳石具有相對穩定的形態、大小結構特征, 其形態具有物種的特異性, 且在一個物種內變化差異較小[2], 因此被廣泛應用于物種鑒定和種群識別。

耳石形態主要分析方法有傳統形態測量法(Traditional morphometry)、框架測量法(Truss network)等傳統幾何測量法, 橢圓傅里葉分析法(Elliptic Fourier analysis)、小波變換(Wavelet transform)、地標點法(Landmark method)等耳石輪廓測量法。在應用耳石形態進行物種的鑒別分析時, 選擇的方法不同, 會顯著地影響鑒別結果。目前, 使用得最為普遍的兩種方法為傳統形態測量法和橢圓傅里葉分析法。傳統形態測量法已被應用于銀鱸科(Gerreidae)[3]、馬鮫屬(Scomberomorus)[4]等的鑒 別研究中; 傅里葉形態分析法已經成功地對圓鲹屬(Decapterus)[5]等進行物種鑒別; 傳統形態測量法結合橢圓傅里葉形態分析法, 已經應用在歐白魚屬(Alburnus)[6]、平鲉屬(Sebastes)[7]、雪冰魚屬(Chionodraco)[8]等的鑒別中。

鸚嘴魚科(Scaridae)隸屬于鱸形目(Perciformes)隆頭魚亞目(Labroidei), 有10屬99種, 主要棲息在珊瑚礁海域[9]。由于其能夠啃食藻類而為珊瑚提供珊瑚礁石上的附著基質, 因此被認為是珊瑚礁的保護生物[10]。鸚嘴魚顏色各異, 種類繁多, 且個體從雌性轉變為雄性、幼魚成長為成魚時鸚嘴魚的體色也會隨之改變[11], 容易鑒別為其他種, 此時形態穩定的耳石便可作為分類的輔助材料。目前為止, 關于鸚嘴魚的研究主要集中在基礎生物學[12]、時空分布[13]和行為特征[14]等方面, 有關鸚嘴魚耳石形態方面的研究較少, 且僅僅停留在文字描述和尺寸參數的研究上[15,16], 在鸚嘴魚物種間形態差異分析方面尚未進行深入的研究。鑒于此, 本研究以西沙群島4屬15種鸚嘴魚為研究對象, 旨在探究基于耳石形態鑒別鸚嘴魚種類的可行性, 結果可為鸚嘴魚的傳統形態分類提供佐證和輔助材料; 比較不同耳石形態測量方法對判別結果的影響, 嘗試找出適合鸚嘴魚耳石形態分類的研究方法; 并探究耳石形態是否具有遺傳的特性。本研究以期為今后西沙群島鸚嘴魚的基礎研究提供科學資料, 為鸚嘴魚資源的保護與開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用鸚嘴魚樣本為2018—2021年采自七連嶼(16°55′—17°00′N, 112°12′—112°21′E)、永興島(16°50′N, 112°20′E)、東島(16°40′N, 112°44′E)、晉卿島(16°27′51″N, 111°44′17″E)、羚羊礁(16°28′N,111°35′E)、全富島(16°32′N, 111°40′E)和銀嶼(16°35′03″N, 111°42′19″E)等西沙群島海域。采集到4屬15種鸚嘴魚(表1), 共計1469尾。將采集到的鸚嘴魚樣本冷凍保存, 隨后統一將全部樣品運回實驗室。在實驗室解凍后立刻鑒定種類, 然后測量體長(精確到1 mm)、體重(精確到0.01 g; 表1), 摘取左、右矢耳石(下文皆簡稱為耳石), 清水洗滌后裝入離心管儲存。

表1 鸚嘴魚樣本的體長、體重數據Tab.1 Body length and weight of Parrotfish

1.2 樣品的處理

耳石均用PS-30A超聲波清洗機(潔康, 東莞)進行清洗后置于101-3QB電熱鼓風干燥箱(明途, 長葛)中50℃干燥12h以上至恒重, 干燥后的耳石使用JJ124BC精密電子天平(G&G, 常熟)進行稱重, 精確至0.0001 g。取耳石近軸面(主凹槽所在面)作為分析面, 耳石的凸面朝上, 水平擺放于解剖鏡下拍攝整體形態, 拍攝時要盡量使耳石擺放的方向一致,減少人為誤差(圖1)。同時在圖像上標注比例尺,便于后續測量。實驗過程中采用LEICA S9D體式顯微鏡(Leika, Germany)、LEICA MC170 HD顯微鏡 攝 像 頭(Leika, Germany)和LAS圖 像 采 集 系 統(Leika, Germany)進行耳石圖像采集。本研究使用的鸚嘴魚耳石均按照圖1的標準進行擺放和拍照(圖2)。

圖1 青點鸚嘴魚左耳石測量示意圖Fig.1 Schematic diagram of Scarus ghobban’s left otolith measurement

圖2 本研究所用鸚嘴魚左矢耳石標本Fig.2 The left sagittal otolith of parrotfish

采集到耳石圖像后使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(Media Cybernetics, USA)對其進行測量,長度數值精確到0.01 mm, 面積數值精確到0.01 mm2。本研究選取了19個耳石形態指標如下(表2), 耳石重量對于生長速度的變化最為敏感, 是一個重要的物種鑒別因素[17], 因此, 本研究將其加入耳石形態表征性參數。耳石的可量形狀參考已有的研究[18—20]。

表2 尺寸參數和形狀指標Tab.2 Sizel parameters and morphological indices of otolith

橢圓傅里葉描述子(Elliptic Fourier descriptors,EFDs)能夠描述閉合二維輪廓的任何形狀[5]。使用SHAPE 1.3軟件包[21]內的ChainCoder程序從耳石圖像提取耳石的整體輪廓, 將提取到的信息儲存為鏈碼, 運行CHC2NEF程序通過耳石的整體輪廓鏈碼的離散傅里葉變換將輪廓鏈碼標準化為傅里葉諧值。研究表明, 隨著傅里葉諧值的增加, 耳石外部輪廓的描述越充分[22]。

由于前10—20組傅里葉諧值能夠描述耳石的主要外形輪廓[23]。本研究使用前20組傅里葉諧值進行分析, 每一組諧值由4個變量(an、bn、cn和dn)組成, 故每個耳石的形態由80個橢圓傅里葉系數描述組成, 由于標準化過程中將耳石的前三個系數轉變為固定值(a1=1, b1=c1=0), 因此研究中采用77個橢圓傅里葉系數(a2—20, b2—20, c2—20, d1—20)進行統計分析。

對左、右耳石的重量和9個原始形態指標進行t檢驗, 結果顯示灰鸚嘴魚的左、右耳石在這些測量指標上均無顯著性差異(P＞0.05; 表3)。因此, 統一使用左耳石進行本研究中鸚嘴魚的耳石形態研究。

表3 灰鸚嘴魚左右耳石差異性比較Tab.3 T-test for the left and right sagittae of Chlorurus sordidus

1.3 數據處理

為了降低體長對分析結果的干擾, 先將體長、耳石形態指標和橢圓傅里葉系數做[lg(x+1.1)]轉換,以提高數據分析的準確性[24]。對選取的19個耳石形態指標和77個橢圓傅里葉系數進行正態性和方差齊性檢驗, 保留符合條件的變量進行下一步的分析; 若數據不滿足條件, 則進行Kruskal-Wallis非參數檢驗, 檢驗各參數在不同物種間的差異性, 保留差異性顯著(P＜0.05)的形態變量用于分析。由于魚類個體生長速率會對魚類耳石形態產生影響, 在做判別分析之前應去除魚類異速生長(Allometric growth)對判別結果造成的偏差[25], 對用于分析的變量進行異速生長校正[26]:

式中,為耳石樣品的平均體長。公式(1)表示兩個形態變量回歸關系的一般形式, 公式(2)表示數據經過對數轉換后帶誤差項的線性關系, 公式(3)表示將任一個觀察值 (X i，Yi)轉換成一個理論值 (*)。將所用到的已經對數據轉化的變量數據按照公式(2)進行回歸分析, 求出參數b, 再按照公式(3)求出每一個變量的轉換值。

本研究以42尾灰鸚嘴魚為例, 對其左、右耳石各原始形態學指標及重量進行獨立樣本t檢驗, 檢驗鸚嘴魚種內左、右耳石的差異性。顯著性水平取α=0.05。分別采用3種方式對15種鸚嘴魚進行判別分析: (1)僅使用19個耳石形態指標; (2)僅使用77個橢圓傅里葉系數; (3)結合19個耳石形態指標和77個橢圓傅里葉系數。對3種方式的交叉檢驗(Cross-validation)結果進行比較。除此之外, 還結合2種參數在鸚嘴魚的屬的層面進行判別分析, 并且對15種鸚嘴魚的耳石形態指標和橢圓傅里葉系數的平均值在物種和屬的層面上進行聚類分析。判別分析使用Fisher逐步判別法, 聚類分析使用歐氏距離系統聚類法, 數據分析使用SPSS 27.0 (IBM,USA)和Excel 2019 (Microsoft, USA)軟件完成。綜合判別率(%) =(判別正確個體數/總個體數)×100%。

2 結果

2.1 鸚嘴魚種層面的耳石形態判別分析

分別采用3種方式對15種鸚嘴魚進行判別分析,交叉驗證結果如表4所示。

僅使用19個耳石形態指標, 15種鸚嘴魚判別率為33.3%—83.3%, 綜合判別率為56.8%, 其中判別率最高的是星眼絢鸚嘴魚, 為94.9%; 判別率最低的是截尾鸚嘴魚和網紋鸚嘴魚, 均為33.3%。僅使用77個橢圓傅里葉系數, 15種鸚嘴魚判別率為36.4%—83.3%, 綜合判別率為63.1%, 其中判別率最高的是小鼻綠鸚嘴魚, 為83.3%, 判別率最低的是鈍頭鸚嘴魚, 為36.4%。結合19個耳石形態指標和77個橢圓傅里葉系數, 15種鸚嘴魚判別率為43.3%—100%, 綜合判別率為75.7%, 其中判別率最高的是星眼絢鸚嘴魚, 為100%, 判別率最低的是截尾鸚嘴魚, 為43.3%。

綜上, 橢圓傅里葉系數分析鸚嘴魚物種的綜合判別率高于耳石形態指標; 結合耳石形態指標和橢圓傅里葉系數的鸚嘴魚物種綜合判別率高于單獨使用其中一種參數。因此, 下文中統一使用耳石形態指標結合橢圓傅里葉系數進行鸚嘴魚的鑒別研究。

結合耳石形態指標和橢圓傅里葉系數對15種鸚嘴魚耳石形態的判別結果見表5。星眼絢鸚嘴魚的判別率最高, 為100%; 灰鸚嘴魚的判別率為76.2%, 剩余的個體誤判為小鼻綠鸚嘴魚和鸚嘴魚屬內的9個物種; 小鼻綠鸚嘴魚的判別率為79.2%,12.5%的個體判為同屬的灰鸚嘴魚, 剩余8.3%判為黑鸚嘴魚; 長頭馬鸚嘴魚的判別率為87.0%, 2.7%的個體判為綠鸚嘴魚屬內的2個物種, 剩余10.3%的個體判為鸚嘴魚屬內的7個物種; 鸚嘴魚屬內11個物種的判別率為43.3%—92.3%, 青點鸚嘴魚的判別率最高, 為92.3%, 只有7.7%的個體判為黃鞍鸚嘴魚;截尾鸚嘴魚的判別率最低, 為43.3%, 剩余個體20.0%判為黑斑鸚嘴魚, 13.3%判為弧帶鸚嘴魚、6.7%判為綠唇鸚嘴魚, 判為長頭馬鸚嘴魚、鈍頭鸚嘴魚、黃鞍鸚嘴魚、網紋鸚嘴魚、許氏鸚嘴魚各3.3%; 其余鸚嘴魚屬內的鸚嘴魚誤判成的物種, 大部分為同屬內的其他物種或者綠鸚嘴魚屬內的物種, 極少數為星眼絢鸚嘴魚和長頭馬鸚嘴魚。

表5 15種鸚嘴魚的耳石形態判別結果Tab.5 Results of otolith morphological discrimination of 15 species of parrotfish

2.2 鸚嘴魚屬層面的判別結果

結合19個耳石形態指標和77個橢圓傅里葉系數, 在鸚嘴魚屬的層面進行判別。結果表明, 鸚嘴魚4個屬的判別率為86.5%—100%, 綜合判別率為88.6%, 其中判別率最高的是絢鸚嘴魚屬, 為100%,判別率最低的是綠鸚嘴魚屬, 為86.5% (表6); 判別函數一能夠解釋52.8%的種間差異, 可以有效地將馬鸚嘴魚屬和鸚嘴魚其他3個屬區分開; 判別函數二能夠解釋26.2%的種間差異, 能夠有效地將絢鸚嘴魚屬和綠鸚嘴魚屬、馬鸚嘴魚屬區分開(圖3),對判別函數一作用最大的參數為橢圓傅里葉系數c3, 對判別函數二作用最大的參數為半徑比。

圖3 鸚嘴魚4個屬的耳石形態判別結果散點圖Fig.3 Scatterplot of otolith morphological discrimination results of four parrotfish genera

表6 鸚嘴魚4個屬的耳石形態判別結果Tab.6 Results of otolith morphological discrimination of four parrotfish genera

2.3 鸚嘴魚種屬層面的耳石形態聚類分析

根據19個耳石形態指標和77個橢圓傅里葉系數, 分別在物種和屬的層面對15種鸚嘴魚進行聚類分析。結果表明, 在物種的層面上, 鸚嘴魚屬內的9個物種和灰鸚嘴魚聚為一支, 再與長頭馬鸚嘴魚聚為一支, 鸚嘴魚屬內的2個物種和小鼻綠鸚嘴魚聚為一支, 這兩支聚為一支后再與星眼絢鸚嘴魚聚類到一起(圖4); 在屬的層面上, 綠鸚嘴魚屬和鸚嘴魚屬聚為一支, 再與馬鸚嘴魚聚為一支, 最后與絢鸚嘴魚屬聚類到一起(圖5)。

圖5 基于耳石形態的鸚嘴魚4個屬的聚類分析圖Fig.5 Cluster analysis of four genera of parrotfish based on otolith morphology

3 討論

3.1 不同方法的物種識別比較

本研究結果表明結合耳石形態指標和橢圓傅里葉系數對鸚嘴魚的物種鑒別效果最好, 其次是橢圓傅里葉系數, 耳石形態指標最差。耳石的體積較小, 且形態多樣, 傳統形態測量法在耳石形態信息的獲取上存在一定的局限性, 只能在一定的程度上反映魚類生長的相關信息, 對耳石的形態輪廓不能進行準確的描述[27]; 而橢圓傅里葉分析方法可以消除因耳石位置、人工測量產生的誤差[28], 對耳石整體形態重建的效果較好, 可以較為清晰地辨別物種之間的形態差異[5]。所以, 相較于耳石形態指標, 使用橢圓傅里葉系數對鸚嘴魚物種的整體識別效果更好, 這與魏聯等[29]的研究結果一致。將耳石形態指標和橢圓傅里葉系數結合起來, 可以識別出耳石形態中微小但很重要的差異[8], 因此, 相比單獨使用其中一種參數, 結合兩種參數的鑒定效果更好。這與多數研究結果一致, 如鰕虎魚(Ponticola)[30]、歐白魚屬[6]、平鲉屬[7]等的種類鑒別結果均顯示是兩種參數結合鑒定的效果最好。

3.2 耳石形態判別分析

本研究中鸚嘴魚物種綜合判別率為75.7%, 屬綜合判別率為88.6%, 低于Bani等[30]研究的94.7%、Bostanci等[6]研究的93.8%, 高于La Mesa等研究[8]的63%。其中, 絢鸚嘴魚屬(星眼絢鸚嘴魚)和馬鸚嘴魚屬(長頭馬鸚嘴魚)的判別率較高, 綠鸚嘴魚屬與鸚嘴魚屬的判別率相對較低。原因可能是(1)耳石在生長過程中并非均勻生長, 同一種魚類中由于個體的生長速率不同可能會存在耳石形態的差異[31]。在相近體長魚類的耳石形態參數選擇及識別過程中, 體長校正能有效降低魚類個體差異對耳石形態分析結果造成的偏差, 但對于體長差異較大的魚類,由于耳石形態特征通常會隨發育階段產生變化, 體長校正這一功能是否有效尚不明確[24]。本研究雖然對選擇的耳石形態參數進行了異速生長校正, 但部分鸚嘴魚物種樣本體長范圍分布較廣, 可能會對判別結果產生一定的影響, 因此導致某些種類判別率偏低。(2)星眼絢鸚嘴魚和長頭馬鸚嘴魚耳石相較其他種類耳石的形狀特殊。星眼絢鸚嘴魚耳石前端兩側有較大缺刻, 長頭馬鸚嘴魚的耳石為橢圓形且前部鈍圓, 這些特征使得它們的耳石在形態識別上更有優勢。綠鸚嘴魚屬(小鼻綠鸚嘴魚和灰鸚嘴魚)耳石均為卵圓形且前部較尖, 這與鸚嘴魚屬中黑鸚嘴魚、弧帶鸚嘴魚、綠唇鸚嘴魚、網紋鸚嘴魚、許氏鸚嘴魚和棕吻鸚嘴魚耳石特征相似, 因此物種相互之間容易造成誤判; 黑斑鸚嘴魚、黃鞍鸚嘴魚、截尾鸚嘴魚和青點鸚嘴魚耳石為梭形且前部較尖, 物種相互之間容易造成誤判。結合耳石形態指標和橢圓傅里葉系數可以對耳石形態差異較大的鸚嘴魚物種進行較好地識別, 但是對于具有相似耳石形態的物種, 形態識別的效果則會降低。(3)在對鸚嘴魚種類進行判別的過程中, 會舍棄無效或者對判別貢獻率小的參數, 從而保留有效參數來進行種類的識別[32]。盡管這種方式保證了參數的有效性, 但也會導致某些耳石形態的缺失, 可能會潛在地造成判別率較低的結果。

3.3 耳石形態聚類分析

鸚嘴魚屬層面的耳石形態聚類分析結果與已有研究[33—36]的鸚嘴魚分子聚類結果一致: 在屬的層面, 鸚嘴魚屬與綠鸚嘴魚屬之間的進化距離最小,親屬關系最近, 其次是馬鸚嘴魚屬, 絢鸚嘴魚屬最遠, 這說明15種鸚嘴魚的耳石形態具有遺傳的屬性;而在物種層面, 本研究結果則與分子聚類結果略有差異。研究表明, 魚類耳石形態是內在和外在因素之間復雜交互的結果, 其中遺傳因素為內在因素,占主導作用[37], 環境[38]、攝食[39]等為外在因素, 起次要作用, 對耳石的表觀形態會有一定影響。因此推測, 這些外在因素的影響可能是導致鸚嘴魚種層面的耳石形態聚類結果與分子聚類結果存在差異的原因。

4 結論

鸚嘴魚種類繁多, 魚體形態和顏色多樣[34], 這會對其分類鑒定造成一定的干擾, 此時形態穩定性較好的耳石便可作為物種鑒定的輔助手段。當樣品保存不當或缺少其他重要分類特征時, 耳石就成為其分類鑒定的關鍵材料。在一些沉積物和魚食類動物胃含物的調查中, 耳石是唯一可以鑒定種類的實驗材料[40]。同時, 相較于分子生物學方法, 耳石形態方法具有方便、快捷和成本低廉等優勢[41]。基于耳石形態學已經對歐白魚屬[6]、鯖屬(Scomber)[41]、方頭魚屬(Branchiostegus)[42]等進行種類鑒別, 且效果良好。本文研究結果表明, 結合耳石形態指標和橢圓傅里葉系數是進行鸚嘴魚種類鑒定可行且有效的手段。

魚類耳石形態研究的準確度需要利用先進的計算機軟件技術實現, 耳石是一個三維的立體材料,基于三維立體的研究能夠更為全面地提取耳石的形態參數, 更加全面地展現耳石多維結構特征, 從而更好地區分魚類物種或類群, 進一步提高魚類物種鑒定的成功率, 這對漁業基礎生物學的研究和漁業資源的管理具有重要的意義。