抗大口黑鱸彈狀病毒發(fā)酵中草藥的篩選及其效果評價

曾榮博 劉 爽 張玉軍 李 陳 余艷枝 李元平肖運才 劉學(xué)芹

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)微生物資源發(fā)掘與利用全國重點實驗室, 武漢 430070; 2.湖北省水生動物病害防控工程技術(shù)研究中心, 武漢 430070; 3.湖北華大瑞爾科技有限公司, 武漢 430070; 4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院, 武漢 430070)

大口黑鱸(Micropterus salmoides)是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類, 又名加州鱸, 黑鱸等。因其肉質(zhì)鮮美, 無肌間刺, 營養(yǎng)價值高, 深受消費者喜愛, 現(xiàn)已成為我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一[1,2]。大口黑鱸彈狀病毒(Micropterus salmoidesrhabdovirus, MSRV)屬于彈狀病毒科, 是單股負(fù)鏈RNA病毒, 病毒粒子形態(tài)似棒狀或子彈狀[2]。這種病毒會造成較高的死亡率, 使大口黑養(yǎng)殖行業(yè)遭受嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。MSRV基因組共有5個開放閱讀框(ORFs), 分別編碼5種不同結(jié)構(gòu)的蛋白, 分別為磷蛋白(Phosphoprotein, P)、糖蛋白(Glycoprotein, G)、核蛋白(Nuclear protein, N)、RNA聚合酶(RNA polymerase, L)和基質(zhì)蛋白(Matrixprotein, M), 3′端到5′端的排列順序為N-P-M-G-L[3]。大口黑鱸彈狀病毒病的暴發(fā)有很強的季節(jié)性, 多發(fā)于每年春季的4、5月和秋季的10、11月, 最易感水溫為25—28℃, 水溫急劇升高或降低時易發(fā)。MSRV主要感染2—5 cm的幼魚, 該病毒傳染性強, 致死率高, 1周內(nèi)死亡率高達90%[4]。MSRV不僅能夠通過養(yǎng)殖水體水平傳播, 還可以通過繁殖垂直傳播[5]。感染MSRV后可導(dǎo)致病魚鰓部有出血點、體色發(fā)黑、體表出血、攝食停止、呈不規(guī)則或螺旋游泳狀態(tài)、身體彎曲、鰭部出現(xiàn)潰爛、拖便等癥狀。組織病理學(xué)觀察可發(fā)現(xiàn)肝臟呈“花肝”樣, 肝、脾、腎腫大、充血; 胃、腸較空, 沒有食物[6]。近年來大口黑鱸彈狀病毒嚴(yán)重危害大口黑鱸養(yǎng)殖行業(yè)。

中草藥具有抗病毒、抗菌和抗寄生蟲作用[7]。發(fā)酵后的中草藥能夠提高活性物質(zhì)的含量, 增強藥效; 降低中草藥的毒性; 還可以產(chǎn)生新活性成分, 提高中草藥的利用率和降低副作用的優(yōu)勢[8], 在我國病害防治方面具有較廣闊的應(yīng)用前景。并因其價格低廉, 作用廣泛, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)也得到應(yīng)用。發(fā)酵中草藥可以增強機體抗病能力, 提高機體免疫力, 提高藥效和抗病毒作用等。湯菊芬等[9]在對吉富羅非魚進行免疫保護率測定時, 使用發(fā)酵中草藥制劑的實驗組效果最好, 說明這些中草藥對增強羅非魚的抗病力效果都有非常顯著的效果。謝炎福[10]使用發(fā)酵中草藥后, 鯽存活率明顯高于單純使用復(fù)方中草藥的對照組, 說明中草藥發(fā)酵劑對鯽出血性疾病有較好的療效。由于發(fā)酵中草藥在抗病毒方面具有良好的效果, 因此近年來發(fā)酵中草藥得到廣泛關(guān)注和研究。

病毒性疾病是我國大口黑鱸養(yǎng)殖行業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個重要制約因素, MSRV導(dǎo)致的大口黑鱸彈狀病毒病, 病程短, 死亡率高, 對大口黑鱸養(yǎng)殖行業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。良好的檢測方法對病毒性疾病的預(yù)防和診斷也至關(guān)重要, 張敏琳等[11]基于CRISPR/Cas13a系統(tǒng)結(jié)合等溫擴增MIRA技術(shù)建立的MSRV檢測方法, 方便快捷、靈敏度高、特異性高, 具有較大的應(yīng)用和推廣前景。目前針對MSRV,暫無有效的藥物治療和預(yù)防。因此本實驗基于湖北華大瑞爾公司開發(fā)的8種發(fā)酵中草藥, 篩選出能夠?qū)SRV具有抑制效果的發(fā)酵中草藥, 在細(xì)胞水平、活體水平上進行安全性、有效性驗證, 為發(fā)酵中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的應(yīng)用提供理論依據(jù), 為魚類傳染病的防控提供科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及毒株

鯉上皮瘤細(xì)胞(Epithelioma papulosum cyprini cells, EPC)來源于筆者所在實驗室細(xì)胞庫。MSRV毒株為本實驗室分離保存[12]。

1.2 實驗試劑

2×TaqPCR Mix、反轉(zhuǎn)錄酶、DNA Marker、購自TaKaRa公司; M199細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液購自Hyclone; 胎牛血清(FBS)購自Gibco公司; MTT試劑盒購自碧云天公司; 2×SYBR 購自愛博泰克生物有限公司;SteadyPureVirus病毒DNA/RNA提取試劑盒購自艾科瑞生物公司。

1.3 引物序列

本研究所用引物序列見表1。

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.4 發(fā)酵中草藥來源、成分及有效物質(zhì)的提取

8種發(fā)酵中草藥由湖北華大瑞爾有限公司提供,名稱依次為L1、L2、L3、L4、L5、X1、X2和ZHS(表2)。發(fā)酵中草藥是使用1—2 cm的中藥材, 將其混合物浸入50%水分的水中, 加熱至80℃ 1h, 然后冷卻至37℃。發(fā)酵菌種使用枯草芽孢桿菌、屎腸球菌和釀酒酵母菌進行聯(lián)合發(fā)酵, 將3種益生菌按不同比例加入加工后的中草藥混合物中, 發(fā)酵72h,干燥, 粉碎而成。

表2 八種發(fā)酵中草藥成分信息Tab.2 Ingredient information for 8 fermented Chinese herbs medicine

稱取5 g發(fā)酵中草藥置于燒杯中, 加入100 mL純凈水, 溫度設(shè)置為100℃, 放置恒溫磁力攪拌器上進行熬制。熬制揮發(fā)至50 mL (濃度為100 mg/mL)時, 冷卻后使用0.22 μm濾器過濾, 過濾后分裝保存。

1.5 發(fā)酵中草藥對細(xì)胞的毒性檢測

將不同濃度的發(fā)酵中草藥加入96孔板中, 孵育24h后使用MTT法, 同時設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT和MTT溶解液), 對照孔(細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT和MTT溶解液), 酶標(biāo)儀在570 nm測定吸光度。

1.6 抗MSRV的發(fā)酵中草藥的篩選

使用0.1 MOI接毒劑量感染EPC細(xì)胞, 置于28℃培養(yǎng)箱中1h, 在5%維持培養(yǎng)基中加入40 μL發(fā)酵中草藥藥液, 離心混勻后加入細(xì)胞孔中, 24h后用TRIzol收集細(xì)胞孔中貼壁細(xì)胞, 提取細(xì)胞RNA, 而后反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 使用qRT-PCR法檢測抗病毒效果。qRT-PCR反應(yīng)程序: 95℃ 3min; 94℃ 25s; 55℃25s; 72℃ 15s, 35個循環(huán); 72℃ 10min。

1.7 發(fā)酵中草藥在細(xì)胞水平上的抗MSRV效果

在安全濃度范圍內(nèi), 選用不同濃度梯度的藥物探究藥物濃度對抗病毒效果的影響。分別設(shè)置攻毒組, 預(yù)防組, 共育組, 治療組。

(1)攻毒組: 用0.1 MOI MSRV緩慢加入細(xì)胞孔中, 置于28℃培養(yǎng)箱中, 并在1h后更換5%維持培養(yǎng)基。

(2)預(yù)防組: 取3個1.5 mL EP管, 每管加入1 mL MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基, 依次加入20、40和80 μL熬制后的發(fā)酵中草藥藥液, 即終濃度為2、4 和8 mg/mL,短暫離心并混勻后緩慢加入細(xì)胞孔中, 置于28℃培養(yǎng)箱中, 4h后棄去培養(yǎng)基, 緩慢加入0.1 MOI MSRV,并在1h后更換5%維持培養(yǎng)基。

(3)共育組: 取3個1.5 mL EP管, 每管加入0.1 MOI MSRV, 依次加入20、40和80 μL熬制后的發(fā)酵中草藥藥液, 即終濃度為2、4 和8 mg/mL, 短暫離心并混勻后緩慢加入細(xì)胞孔中, 置于28℃培養(yǎng)箱中, 并在1h后更換添加5%血清的維持培養(yǎng)基。

(4)治療組: 將3個細(xì)胞孔中緩慢加入0.1 MOI MSRV, 置于28℃培養(yǎng)箱中, 并在1h后棄去病毒液。取3個1.5 mL EP管, 每管加入1 mL添加5%血清的維持培養(yǎng)基, 依次加入20、40 和80 μL熬制后的發(fā)酵中草藥藥液, 即終濃度為2、4 和8 mg/mL,短暫離心并混勻。

24h后收集細(xì)胞上清, 凍存于-80℃冰箱, 用于空斑實驗。每孔用1 mL TRIzol將貼壁細(xì)胞緩慢吹打下來, 吸出后放入2 mL EP管中。用TRIzol法提取RNA后并進行反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 使用qRT-PCR法檢測抗病毒效果。

1.8 空斑實驗(Plaque assay)

本實驗使用空斑實驗檢測病毒滴度, 實驗步驟: (1)將細(xì)胞接種到24孔板中, 待單層細(xì)胞長至100%用于病毒感染; (2)無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次, 每個樣品取5個2 mL EP管, 每管中加入1800 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基, 在第一管中加入200 μL樣品, 震蕩混勻吸取200 μL后加入第2個EP管中, 以此類推, 10倍梯度稀釋病毒。在24孔板中每孔加入500 μL的病毒液, 每個濃度做3次重復(fù), 置于28℃培養(yǎng)箱孵育1h; (3)用無血清培養(yǎng)基清洗1次, 加入1 mL含有甲基纖維素半固體培養(yǎng)基; (4) 28℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)60—72h, 待形成肉眼可見空斑后用10%的甲醛固定12h, 自來水沖洗干凈; (5)倒扣在吸水紙上晾干,加結(jié)晶紫染色液染色3h, 自來水沖洗干凈后晾干,計算讀數(shù)。

1.9 大口黑鱸攜帶病毒檢測

大口黑鱸28℃暫養(yǎng)7d后, 隨機取3條, 勻漿后混勻。使用DNA/RNA提取試劑盒進行RNA/DNA提取。采用特異性引物進行PCR檢測有無攜帶病毒。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.10 發(fā)酵中草藥對魚體的毒性實驗

大口黑鱸28℃暫養(yǎng)7d后, 取50條分為5個組, 沿胸鰭基部注射0、5、20、100和1000 μg (體積為10 μL)發(fā)酵中草藥藥液, 記錄死亡率。

1.11 發(fā)酵中草藥在魚體水平抗MSRV效果檢測及效果評定

大口黑鱸28℃暫養(yǎng)7d后, 取150條分為5個組做不同處理, 分別為藥物組、對照組、攻毒組、預(yù)防組、治療組。

藥物組: 沿胸鰭基部注射10 μL發(fā)酵中草藥藥液, 注射30條;

對照組: 沿胸鰭基部注射10 μL MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基, 注射30條;

預(yù)防組: 沿胸鰭基部注射10 μL的發(fā)酵中草藥藥液, 36h后, 將107PFU的MSRV用MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋10倍后, 沿胸鰭基部注射10 μL;

治療組: 將107PFU的MSRV使用發(fā)酵中草藥藥液稀釋10倍后, 沿胸鰭基部注射10 μL;

攻毒組: 使用MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基將107PFU的MSRV稀釋10倍后, 沿胸鰭基部注射10 μL。觀察10d, 記錄死亡率和存活率。并同時設(shè)置取樣組, 取大口黑鱸肝臟組織和脾臟組織, 做HE染色病理切片及組織病毒載量檢測。用TRIzol法提取RNA后并進行反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過qRT-PCR的方法檢測MSRV-G基因的水平, 來檢測X1藥物不同濃度不同處理方式抗MSRV的能力。

1.12 組織病理學(xué)觀察

分別取魚的肝、脾組織, 4%多聚甲醛固定24h,各組織分別經(jīng)70%、80%、95%和100%乙醇脫水,二甲苯透明、石蠟包埋切片(5—7 μm)、HE染色,最后在顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測發(fā)酵中草藥對細(xì)胞的毒性

通過MTT法檢測發(fā)酵中草藥(L1、L2、L3、L4、L5、X1、X2和ZHS)對細(xì)胞的毒性, 結(jié)果表明發(fā)酵 中 草藥L1、L2、L3、X1、X2和ZHS未對EPC細(xì)胞造成明顯的損傷和毒性, 細(xì)胞存活率無顯著差異。中草藥L4和L5在4 mg/mL時對細(xì)胞造成損害, L4處理后細(xì)胞存活率下降約50%, L5處理后細(xì)胞存活率下降80%。此外, 中草藥X1和X2表現(xiàn)出促進EPC細(xì)胞生長的作用(圖1)。

圖1 八種發(fā)酵中草藥對 EPC細(xì)胞的毒性檢測Fig.1 The toxicity of eight kinds of fermented Chinese herbal medicines to EPC cells

2.2 抗MSRV的發(fā)酵中草藥篩選

MSRV感染EPC細(xì)胞后, 在12孔板中加入8種中草藥, 24h后收取細(xì)胞樣。根據(jù)qRT-PCR檢測結(jié)果表明, 8種發(fā)酵中草藥對MSRV都有明顯的抗病毒效果, 能夠顯著抑制MSRV的感染, 其中X1效果最好(圖2), 因此選X1藥物進行后續(xù)的效果評價實驗。

圖2 八種發(fā)酵中草藥抗MSRV的效果篩選Fig.2 Screening of the anti-MSRV effects of eight fermented Chinese herbal medicines

2.3 X1藥物在細(xì)胞水平上的抗MSRV效果

使用不同方式進行處理EPC細(xì)胞后, 24h后收取細(xì)胞樣。qRT-PCR檢測結(jié)果表明X1藥物3種處理方式對MSRV都有明顯的抗病毒效果, 且治療組效果最為明顯, 其次為預(yù)防組和共育組。其中在治療組和共育組, X1藥物表現(xiàn)出其抗病毒效果與藥物濃度呈正相關(guān)關(guān)系(圖3A—C)。

圖3 發(fā)酵中草藥X1在細(xì)胞水平上的抗MSRV效果Fig.3 Anti-MSRV effect of fermented Chinese herbal medicine X1 at the cellular level

收集細(xì)胞病毒上清, 通過空斑實驗檢測X1藥物抗MSRV的能力。空斑實驗結(jié)果表明經(jīng)過X1藥物處理后, 預(yù)防組、共育組和治療組都使MSRV的病毒滴度降低10倍左右。其中共育組和治療組抗病毒效果與藥物濃度呈正相關(guān)關(guān)系, 濃度為8 mg/mL時效果最好。預(yù)防組在濃度為4 mg/mL時效果最為顯著(圖3D—G)。

2.4 大口黑鱸攜帶病毒檢測

為檢測大口黑鱸是否攜帶其他病毒, 針對大口黑鱸易攜帶的病毒(LMBV、ISKNV、MSRV和NNV)進行檢測。通過PCR基因擴增瓊脂糖凝膠電泳后,未看到特異性條帶, 證明大口黑鱸未攜帶LMBV、ISKNV、MSRV和NNV。

2.5 發(fā)酵中草藥對魚體的毒性實驗

大口黑鱸胸鰭基部注射10 μL藥物濃度為0、0.5、2、10和100 mg/mL的發(fā)酵中草藥液, 統(tǒng)計死亡率。根據(jù)實驗結(jié)果表明發(fā)酵中草藥未對魚體造成傷害及死亡, 存活率100% (表3)。

表3 大口黑鱸存活率Tab.3 Survival rate of largemouth bass

2.6 X1藥物在魚體水平抗MSRV存活率檢測

設(shè)置不同處理方式, 進行大口黑鱸存活率檢測。分別為空白對照組、攻毒組、預(yù)防組、治療組、藥物對照組。處理后觀察7d, 記錄每天的死亡率。結(jié)果表明, 攻毒組在第2天出現(xiàn)大量死亡, 第4天時全部死亡, 存活率為0; 預(yù)防組和治療組均能提高大口黑鱸存活率, 預(yù)防組存活率提高10%, 治療組存活率提升20%, 治療組效果優(yōu)于預(yù)防組(圖4)。

圖4 大口黑鱸存活率檢測Fig.4 Results of largemouth bass survival assay

2.7 X1 藥物對大口黑鱸肝臟、脾臟組織病毒載量作用的結(jié)果

根據(jù)大口黑鱸不同組織病毒載量檢測結(jié)果表明, 第1天在肝臟組織中, 預(yù)防組和治療組對MSRV的增殖有明顯抑制效果; 在脾臟組織中, 預(yù)防組與攻毒組相比差異不顯著; 治療組對MSRV具有明顯的抑制效果。第3天在肝臟組織中, 預(yù)防組和治療組與攻毒組相比都具有明顯差異; 在脾臟組織中,預(yù)防組和攻毒組病毒載量差異不顯著, 治療組具有顯著差異。綜上結(jié)果, X1對MSRV具有良好的抗病毒作用(圖5)。

圖5 大口黑鱸組織病毒載量測定Fig.5 Measurement of tissue viral load in largemouth bass

2.8 組織病理學(xué)觀察

大口黑鱸肝臟組織切片觀察發(fā)現(xiàn)對照組肝臟組織結(jié)構(gòu)正常, 肝索、肝細(xì)胞排列緊密; 肝竇未見擴張。治療組未見明顯變化; 預(yù)防組少量肝細(xì)胞輕度水腫; 攻毒組視野內(nèi)大量肝細(xì)胞輕度水腫, 細(xì)胞腫脹, 胞漿淡染, 可見大量圓形空泡, 肝實質(zhì)內(nèi)可見炎癥細(xì)胞浸潤(圖6)。

圖6 大口黑鱸肝臟組織切片F(xiàn)ig.6 Liver tissue sections of largemouth bass

大口黑鱸脾臟組織切片觀察發(fā)現(xiàn), 預(yù)防組和治療組與對照組相比未見明顯異常, 脾組織結(jié)構(gòu)正常。攻毒組脾組織結(jié)構(gòu)異常, 視野內(nèi)脾組織明顯水腫, 部分細(xì)胞呈空泡樣變性, 組織間隙增大, 紅髓內(nèi)小淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖7)。

3 討論

水產(chǎn)養(yǎng)殖病害已嚴(yán)重影響了我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展, 并且病毒性傳染病對水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)危害巨大, 其傳播速度快, 能夠造成魚體大量死亡。大口黑鱸肉質(zhì)鮮美, 營養(yǎng)價值高, 經(jīng)濟價值高, 屬于名特優(yōu)魚類。然而大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)受到病毒的威脅, 其中大口黑鱸彈狀病毒主要感染大口黑鱸幼魚導(dǎo)致較高的死亡率, 是大口黑鱸主要的病原。近年來MSRV對水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)帶來的危害逐年遞增, 我國多地報道了MSRV感染事件, 給大口黑鱸養(yǎng)殖行業(yè)帶來了一定的經(jīng)濟損失。目前針對該病毒無有效的商品化治療手段, 對MSRV的防治以疫苗和藥物開發(fā)為主要方向。大口黑鱸彈狀病毒疫苗已經(jīng)有減毒活疫苗及亞單位疫苗的相關(guān)研究, 使用疫苗后可以提高非特異性免疫水平和特異性的抗體水平, 在實驗室水平下都有可觀的保護率[13—16]。但是MSRV的主要感染對象是幼魚, 沒有成熟的免疫系統(tǒng), 接種疫苗后很難產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答, 疫苗的商品化應(yīng)用存在一定難度。鑒于此, 針對MSRV的藥物開發(fā)是一種更有效的治療手段, 有研究發(fā)現(xiàn)多種天然植物提取物及合成的化合物具備作為治療MSRV藥物的潛力。張雨[17]篩選出3種對MSRV具有明顯抑制效果的化合物, 分別為鳥嘌呤核苷、阿糖腺苷、牛蒡子苷元。對MSRV的抑制率分別為95.77%、83.3%和54.73%。Yang等[18]研究結(jié)果表明利巴韋林對MSRV也具有良好的抗病毒效果,能夠抑制MSRV感染的CPE和核損傷, 這一發(fā)現(xiàn)可為水產(chǎn)養(yǎng)殖抗MSRV藥物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)提供參考。杭小英等[1]選擇了8種中草藥(板藍(lán)根、黃芪多糖、白花蛇舌草、金銀花、黃藤素、葡萄糖酸鋅、白芍及連翹)進行體外抗病毒實驗, 結(jié)果表明,黃芪多糖、白芍、金銀花等對MSRV都有良好的抗病毒效果。中草藥是中國特有的技術(shù), 已經(jīng)從中草藥中發(fā)現(xiàn)大量有效的藥物, 由于其低耐藥性、低毒性, 從中草藥中開發(fā)治療MSRV的藥物也是有效的嘗試。

3.1 發(fā)酵中草藥X1顯著抑制MSRV感染

本研究中篩選出發(fā)酵中草藥X1, 在細(xì)胞水平上和魚體水平上對MSRV有較好的抗病毒效果, 其成分為魚腥草、板藍(lán)根、南芪和杏仁。有研究表明,魚腥草水提物通過阻斷NF-κB的激活來阻斷單純皰疹病毒2型的感染, 從而發(fā)揮抗病毒效果[19]; 而魚腥草揮發(fā)油提取物對1型皰疹病毒具有良好的抗病毒效果; 并且魚腥草揮發(fā)油在發(fā)揮其抗病毒效果時, 對細(xì)胞無毒性[20]。此外, 魚腥草對其他病毒(EV71、DENV-2、NDV、ZIKV等)也具有良好的抗病毒效果。板藍(lán)根的主要成分為板藍(lán)根多糖, 板藍(lán)根多糖能夠直接作用8種流感病毒和殺滅豬偽狂犬病毒及豬流感病毒H3N2[21]。南芪和杏仁研究相對較少, 南芪具有提高抗應(yīng)激能力, 增強免疫功能和補血作用[22]。杏仁具有抗炎, 抗腫瘤, 免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[23]。因此, 在X1復(fù)方發(fā)酵中草藥中, 可能是魚腥草和板藍(lán)根主要發(fā)揮了抗病毒作用, 南芪和杏仁可能發(fā)揮了抗應(yīng)激、抗炎等功能。

本研究表明X1發(fā)酵中草藥對MSRV具有良好的抗病毒效果, 在細(xì)胞水平上的實驗結(jié)果能夠表明X1能夠顯著抑制MSRV感染, 在魚體水平上對大口黑鱸的存活率提高了20%。相關(guān)研究表明, 厚樸酚及其衍生物在濃度為40 mg/kg時將大口黑鱸的存活率提高了72%; 幾種香豆素類化合物在體外也具有顯著的抗SVCV效果, 但是在體內(nèi)的抗病毒效果也并不顯著, 導(dǎo)致這一原因可能是由于藥物在魚體內(nèi)代謝過快或是藥物利用率低等。因此本研究推測是由于藥物濃度低, 魚體代謝快, 利用率較低等導(dǎo)致在魚體上抗病毒效果不佳。后續(xù)可具體探究發(fā)揮其抗病毒效果的有效成分, 對有效成分進行提取或合成化合物, 在實際應(yīng)用中發(fā)揮作用。

3.2 發(fā)酵中草藥的給藥方式

本研究使用魚體注射的方式, 注射具有吸收快,藥物直接進入體內(nèi)發(fā)揮作用等優(yōu)點。研究表明腹腔注射8-羥基喹啉及熊果酸都可以分別提高15%和12.5%的鱸感染MSRV的相對存活率[24,25]。所以我們首先使用了注射的方式評價X1發(fā)酵中草藥對MSRV感染大口黑鱸的影響。未探究與口服、浸泡等其他使用方式之間的差異。某些中草藥使用浸泡、潑灑、口服等方式也可以發(fā)揮較好的效果。在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的實際應(yīng)用上, 注射的給藥方式成本高, 操作不便, 且注射方式可能會對幼魚產(chǎn)生應(yīng)激, 且會對魚體產(chǎn)生機械性損傷, 從而會導(dǎo)致幼魚存活率降低。因此, 注射產(chǎn)生的效果與口服給藥的效果在差異不顯著的情況下, 口服給藥的方式更具有操作簡便、可行性強、成本低的優(yōu)勢。不同的提取方式帶來的效果也可能存在差異, 應(yīng)根據(jù)中草藥在實際應(yīng)用時來選定最適合最有效的使用方法。在后續(xù)的研究中, X1發(fā)酵中草藥的口服給藥、浸泡給藥等其他使用方式也是值得進一步探究的。

本研究篩選出對MSRV具有良好抗病毒效果的中草藥, 并從體外實驗和魚體實驗評定其抗病毒效果, 這為中草藥及發(fā)酵中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的防控應(yīng)用提供參考依據(jù), 為中草藥抗水產(chǎn)病毒性疾病及將來開發(fā)抗病毒藥物具有重大意義。