持續(xù)高糖狀態(tài)對(duì)Kv11.1離子通道蛋白表達(dá)的影響

韓穩(wěn)琦,王 毅,陳海潮,尤紅俊,鄧紀(jì)釗,祁 杰

(陜西省人民醫(yī)院心血管內(nèi)二科,陜西 西安 710068)

長(zhǎng)QT綜合征(Long Q-T Syndromes,LQTS)可由快速延遲整流鉀電流(Rapid component of delayed rectifier potassium current,IKr)的降低引起,IKr是人類ether-á-go-go相關(guān)基因(the human Ether-à-go-go-Related Gene,hERG)編碼的心臟快速延遲整流鉀通道(Kv11.1)α亞單位[1-4]。Ikr是動(dòng)作電位復(fù)極期重要的外向離子流,各種因素及藥物致Kv11.1表達(dá)減少及通道異常使IKr振幅減低導(dǎo)致QT間期異常易引起心肌心內(nèi)外膜和M層細(xì)胞復(fù)極不均一,從而發(fā)生尖端扭轉(zhuǎn)性室速(Torsade de pointes,TdP),甚至猝死[5-8]。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者心臟中hERG通道的表達(dá)顯著下調(diào),這種下調(diào)是糖尿病復(fù)極減慢和QT間期延長(zhǎng)的關(guān)鍵因素[9-10]。然而,對(duì)糖尿病誘導(dǎo)的IKr/hERG功能障礙的認(rèn)識(shí)尚不完全,然而,目前尚不清楚不同葡萄糖濃度hERG的表達(dá)及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)是否發(fā)生改變。

本研究構(gòu)建了以EGFP為報(bào)告基因的增強(qiáng)子真核表達(dá)重組質(zhì)粒,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染構(gòu)建HEK239T模型,以期通過EGFP 的自發(fā)熒光特點(diǎn)對(duì)HERG蛋白表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。本研究通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染EGFP標(biāo)記得HERG基因在HEK239T模型中明確地證明pEGFP-N1-HERG在不同濃度葡萄糖干預(yù)后KV11.1的表達(dá),為糖尿病患者長(zhǎng)期高糖狀態(tài)時(shí)KV11.1通道異常導(dǎo)致QT間期延長(zhǎng)的分子學(xué)機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 pcDNA3-HERG-C2質(zhì)粒(氨芐青霉素抗性)由Wisconsin大學(xué)BD Anson教授贈(zèng)予,pEGFP-N1質(zhì)粒(卡那霉素抗性)購(gòu)自Sigma公司,EcoRI和HindⅢ限制性內(nèi)切酶、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶及500～15000 bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)ladder購(gòu)自Fermentas公司,T4-DNA Ligase購(gòu)自Invitrogen公司,DNA轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒提取試劑盒均為Roche公司產(chǎn)品,DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清為西安沃爾森公司產(chǎn)品,核酸染料和DH5α大腸桿菌購(gòu)自西安昕泰生物公司,卡那霉素購(gòu)自西安沃爾森生物公司。2000型凝膠成像系統(tǒng):美國(guó)Biotech公司,HEK293T細(xì)胞株取自我校心臟離子通道病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,葡萄糖粉購(gòu)自sigma公司,流式細(xì)胞儀(FALS CALIBAR BD公司),常用試劑為本實(shí)驗(yàn)室配制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 真核表達(dá)載體pEGFP-N1-HERG的構(gòu)建和擴(kuò)增:利用HERG在GenBank基因序列基因兩側(cè)單一的EcoRI和HindⅢ限制性內(nèi)切酶雙酶切pcDNA3-HERG及pEGFP-N1,同時(shí)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證條帶位置,T4 DNA連接酶將含有HERG的片段和pEGFP-N1片段連接起來,重組成pEGFP-N1-HERG綠色熒光真核表達(dá)載體并進(jìn)行堿基序列測(cè)序。新構(gòu)建質(zhì)粒采用大腸桿菌DH5α進(jìn)行轉(zhuǎn)化,LB-卡那霉素培養(yǎng)基篩選新構(gòu)建產(chǎn)物,37 ℃培養(yǎng)溫箱孵育20 h后挑選單菌落于25 ml LB-卡那霉素培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)增,細(xì)胞裂解法提取質(zhì)粒后再次將新構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-N1-HERG送上海生工生物有限公司進(jìn)行堿基序列測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 HEK293T細(xì)胞(Human embryo kidney cell)培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:將HEK293T細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2條件培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前均勻種植于六孔培養(yǎng)皿中,24 h后待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至50%～70%時(shí),采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。預(yù)混物包括無(wú)血清DMEM 100 μl、轉(zhuǎn)染劑4 μl,pEGFP-N1-HERG 3 μg。

1.2.3 葡萄糖干預(yù)及融合蛋白表達(dá)鑒定:質(zhì)粒轉(zhuǎn)染4 h后給予不同濃度葡萄糖(5、17.5、30 mmol/L)干預(yù)細(xì)胞,24 h后換液再次給予以上濃度葡萄糖序貫干預(yù)細(xì)胞,48 h后PBS收獲細(xì)胞行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率及熒光強(qiáng)度參數(shù)進(jìn)行分析HERG綠色熒光融合蛋白表達(dá)。每個(gè)樣品的質(zhì)粒表達(dá)效率鑒定以流式細(xì)胞儀在488 nm波長(zhǎng)激發(fā)下,于530 nm處獲取1×104個(gè)細(xì)胞的平均綠色熒光值進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 綠色熒光表達(dá)載體pEGFP-N1-HERG的構(gòu)建 用HindⅢ和EcoRI限制性內(nèi)切酶雙酶切pcDNA3-HERG和pEGFP-N1。瓊脂糖凝膠電泳定位,pEGFP-N1為一條目的條帶,約4000 bp和5000 bp Marker之間;pcDNA3-HERG被切成很接近的兩條目的條帶,瓊脂糖電泳如圖1所示,與預(yù)計(jì)大小相同。將pcDNA3-HERG的小片段基因條帶和pEGFP-N1端基因條帶通過T4 DNA連接酶進(jìn)行基因融合,重組成pEGFP-N1-HERG綠色熒光真核表達(dá)載體。與預(yù)期的pEGFP-N1和結(jié)合蛋白目的基因片段長(zhǎng)度一致(圖1)。

圖1 質(zhì)粒pcDNA3-HERG和pEGFP-N1的雙酶切電泳圖

2.2 綠色熒光表達(dá)載體pEGFP-N1-HERG的鑒定

2.2.1 酶切鑒定:由于目的基因HERG和pEGFP-N1載體基因序列中均有一處BamHⅠ酶切位點(diǎn),因此重組真核表達(dá)載體pEGFP-N1-HERG可被BamH Ⅰ酶切成4000 bp和5000 bp兩條帶,與預(yù)計(jì)大小相同(圖2)。

圖2 質(zhì)粒pEGFP-N1-HERG酶切電泳圖

2.2.2 測(cè)序分析鑒定:將HERG基因成功連接到pEGFP-N1載體上,pEGFP-N1-HERG測(cè)序行雙向測(cè)通后的測(cè)序結(jié)果與美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生圖書館Genebank中HERG基因堿基序列進(jìn)行匹配比對(duì),結(jié)果示pEGFP-N1-HERG載體中插入的HERG基因堿基序列與Genebank中的序列匹配一致,保證了正常HERG蛋白的表達(dá)及通道功能的實(shí)現(xiàn)。

2.2.3 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞pEGFP-N1-HERG表達(dá):pEGFP-N1-HERG轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下可見融合有綠色熒光蛋白的目的蛋白在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)(圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)染后HEK293T細(xì)胞熒光表達(dá)(脂質(zhì)體染色,×10)

2.3 EGFP表達(dá)的流式細(xì)胞儀分析 流式細(xì)胞儀分析表明三組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-N1-HERG的HEK293T細(xì)胞經(jīng)不同糖濃度(5、17.5、30 mmol/L)干預(yù)后EGFP轉(zhuǎn)染陽(yáng)性效率分別為(69.29±6.05)%、(68.74±11.37)%和(73.92±12.11)%,轉(zhuǎn)染效率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05),而HEK293細(xì)胞EGFP相對(duì)平均熒光強(qiáng)度分別為209.18±9.99、187.11±11.43和124.47±27.30,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。見表1(圖4)。

表1 葡萄糖干預(yù)48 h后流式計(jì)數(shù)pEGFP-N1-HERG的陽(yáng)性細(xì)胞百分比和平均熒光強(qiáng)度

A:葡萄糖5 mmol/L;B:葡萄糖17.5 mmol/L;C:葡萄糖30 mmol/L

3 討 論

HERG基因編碼心肌細(xì)胞快速延遲整流電壓門控鉀通道(Kv11.1)α亞單位,是心肌動(dòng)作電位復(fù)極期重要的外向電流,各種因素致Kv11.1通道異常使IKr振幅減低,導(dǎo)致LQTS,從而誘發(fā)尖端扭轉(zhuǎn)性室速(TdP),增加心律失常和猝死的風(fēng)險(xiǎn)[11-13]。并且Kv11.1是多種藥物致QT間期改變甚至誘發(fā)心律失常的結(jié)合位點(diǎn),同時(shí)也是抗心律失常藥治療的重要靶點(diǎn)區(qū)域[14]。

pEGFP-N1是一種小分子量并優(yōu)化的突變型增強(qiáng)GFP,蛋白大小約26.9kDa,其具有更高的靈敏度和熒光強(qiáng)度,且熒光性質(zhì)穩(wěn)定,沒有物種特異性,對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能無(wú)顯著的影響,可行活細(xì)胞檢測(cè)[15]。近年大量研究廣泛采用將目的基因重建到攜帶熒光蛋白基因的pEGFP-N1表達(dá)載體中構(gòu)建成表達(dá)綠色熒光融合目的蛋白細(xì)胞模型,在熒光顯微鏡下根據(jù)綠色熒光強(qiáng)弱及位置反映目的蛋白表達(dá)量及轉(zhuǎn)運(yùn)定位,且EGFP對(duì)靶基因產(chǎn)物的空間構(gòu)象和功能沒有影響,它已成為檢測(cè)目的基因表達(dá)方式的最佳報(bào)告基因[16-19]。此目的蛋白自帶增強(qiáng)熒光的細(xì)胞模型在研究蛋白表達(dá)及定位較免疫熒光法更加方便快捷,簡(jiǎn)化和節(jié)省了免疫熒光后期的抗體孵育及顯色時(shí)間;還可在不需要額外熒光抗體標(biāo)記的情況下快速進(jìn)行精確的流式細(xì)胞學(xué)研究[20]。

QT間期異常延長(zhǎng)是糖尿病(DM)患者最顯著的心電障礙,同時(shí)LQTS患者也表現(xiàn)出更高的糖尿病負(fù)荷。眾所周知,hERG編碼快速延遲IKr,HERG通道易受遺傳缺陷和環(huán)境因素的影響,在大多數(shù)情況下會(huì)導(dǎo)致HERG功能的抑制[21]。事實(shí)上,大多數(shù)長(zhǎng)QT綜合征的病例都?xì)w因于HERG通道的功能障礙,尤其是治療藥物引起的功能障礙[22-23]。可以推測(cè),HERG的改變也可能參與了高血糖誘導(dǎo)的QT延長(zhǎng),在糖尿病心肌病中,hERG通道的表達(dá)嚴(yán)重下調(diào),這種下調(diào)是減慢復(fù)極和延長(zhǎng)QT間期的關(guān)鍵因素。本研究發(fā)現(xiàn)在高糖處理的hERG-hek細(xì)胞中,hERG蛋白的表達(dá)隨高糖濃度依賴性降低,和SHI研究結(jié)果一致[24]。既往研究發(fā)現(xiàn)高糖通過影響Hsp90的表達(dá)及其與hERG的相互作用抑制hERG通道的生成。此外,高糖誘導(dǎo)的hERG通道抑制可以通過上調(diào)激活轉(zhuǎn)錄因子-6和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白calnexin的表達(dá)水平來激活未折疊蛋白應(yīng)答,表明抑制非成熟hERG蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)是糖尿病心肌病中hERG缺乏的潛在機(jī)制[24]。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在胰島素存在下,由高糖引起的Hsp90的抑制顯著恢復(fù),Hsp90的表達(dá)增加,這些結(jié)果表明胰島素通過降糖可以上調(diào)hERG通道的表達(dá),并拯救高糖引起的hERG通道蛋白缺失。還有研究報(bào)道高糖誘導(dǎo)的hERG通道缺乏是由于抑制了蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的折疊和轉(zhuǎn)運(yùn),此外也證實(shí)胰島素可促進(jìn)hERG通道的表達(dá),改善高糖誘導(dǎo)的hERG通道抑制的潛在機(jī)制[25]。還有些研究報(bào)道hERG蛋白表達(dá)減少是由氧化應(yīng)激引起的,可能由高糖刺激導(dǎo)致的活性氧自由基(ROS)參與的氧化應(yīng)激所致,而胰島素具有抗氧化特性并降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平[25]。此外,胰島素通過其抗氧化作用改善糖尿病模型家兔IKr/hERG功能,該研究也證實(shí)胰島素顯著增加了Kv11.1蛋白和Ikr電流的表達(dá)。此外,高糖誘導(dǎo)的Kv11.1蛋白和Ikr電流的降低可以通過胰島素來改善,源于胰島素可抑制高糖條件下Kv11.1通道蛋白表達(dá)減少的作用。上述研究均證實(shí)高糖誘導(dǎo)的Kv11.1功能障礙是可預(yù)防和可逆的,而胰島素在治療這些糖尿病患者心電問題中是非常有效的。

本研究證明在高糖處理的hERG-HEK293T細(xì)胞中,hERG蛋白表達(dá)隨高糖濃度依賴性降低。既往研究發(fā)現(xiàn)高糖通過抑制Hsp90和hERG/Hsp90復(fù)合物的表達(dá),誘導(dǎo)hERG通道轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷,隨后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和增加的蛋白質(zhì)降解在高糖處理的hERG-HEK293細(xì)胞中被激活。此外,研究還證實(shí)應(yīng)用胰島素可以恢復(fù)hERG蛋白的表達(dá)和hERG電流。這些發(fā)現(xiàn)表明,抑制轉(zhuǎn)運(yùn)是糖尿病心肌病中hERG缺乏的潛在機(jī)制。

綜上所述,本研究證實(shí)持續(xù)高糖狀態(tài)通過抑制hERG的表達(dá)導(dǎo)致Kv11.1蛋白生成減少,致使IKr門控離子通道功能異常,導(dǎo)致K+外流減少,復(fù)極時(shí)間延長(zhǎng),在心電圖上表現(xiàn)為QT間期延長(zhǎng),易誘發(fā)尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過速。這一發(fā)現(xiàn)闡明了糖尿病誘導(dǎo)的hERG通道表達(dá)缺陷的一種細(xì)胞內(nèi)機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)將極大地改善目前對(duì)糖尿病心肌病中hERG蛋白表達(dá)降低的認(rèn)識(shí),為進(jìn)一步研究高糖在hERG細(xì)胞中的作用奠定了基礎(chǔ),并可能為糖尿病患者的長(zhǎng)期高糖狀態(tài)下QT間期延長(zhǎng)提供有效的研究基礎(chǔ)。