右美托咪定通過沉默信息調節因子1/核轉錄因子信號通路調控腦梗死大鼠海馬組織炎癥機制研究

李顯碧,劉尚升,肖 兵,廖 華,張 楊

(1.江油市人民醫院麻醉科,四川 江油 621700;2.興文縣人民醫院麻醉科,四川 興文 644400)

腦卒中是指腦組織局部發生出血或缺血性病理改變而引起腦組織血液供給降低,繼而引起嚴重神經功能缺損癥狀的神經系統疾病,是全球范圍內引起人類死亡的主要原因,也是致殘的第二大原因[1-2]。統計學結果表明,每年約有1500萬以上新發卒中患者,其中病死人數可達三分之一。腦卒中可分為出血性卒中和缺血性卒中,其中后者又稱為腦梗死,占腦卒中患者總數的85%[2]。目前臨床中,針對缺血性腦卒中的主要治療方法為手術治療和抗血小板聚集、神經保護、溶栓等藥物治療。抗凝藥對患者的副作用較多,溶栓藥的治療效果較好,但有效治療時間窗狹窄和易引起顱內出血、致殘率較高等因素導致其應用受限。因此,深入探究腦梗死的發病機制,尋求針對性的治療藥物或療法,是臨床中亟須解決的問題。

研究表明,腦梗死發生后,白細胞、星形膠質細胞等炎性細胞被激活,產生大量炎性因子[3-4],其中核轉錄因子κB(Nuclear factor κ gene binding,NK-κB)是炎性反應中的關鍵調節因子,可以通過調控腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)和白細胞介素-6(Interleukin,IL-6)等促炎性因子的表達進而促進炎性反應的加重[4]。沉默信息調節因子1(Silent information regulation 1,SIRT1)是一組在腦、肝臟、脂肪等多種器官和組織中廣泛分布的蛋白去乙酰化酶,主要表達于細胞核中,通過對組蛋白以及NK-κB的去乙酰化作用,參與體內細胞凋亡、氧化應激、炎性反應和增殖等生理活動,在維持生理功能和某些疾病發生發展過程中發揮重要作用,與腦梗死的發生發展密切相關[5]。

右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)是一種常用的α2-腎上腺素能受體激動劑,具有較好的抗炎、鎮痛作用,常用于腦組織受損的疾病中發揮神經保護效用[6],但此藥的詳細作用機制尚未完全明晰,仍需進一步探究。因此,本研究擬采用Longa法制備腦梗死大鼠模型,探究Dex對腦梗死大鼠治療作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:選擇SPF級SD雄性大鼠共60只,體重(200±20)g,實驗動物購于北京維通利華實驗動物技術公司[許可證編號SCCK(京)2016-0011]。所有大鼠均進行1周適應性飼養,自由飲食飲水,保持12 h/12 h光暗周期。

1.1.2 實驗藥品:鹽酸右美托咪定注射液購(規格1ml:0.1mg,國藥準字H20143195)。

1.1.3 實驗儀器:大腦中動脈栓塞(MCAO)線栓(北京西濃科技),蛋白質電泳儀(美國Bio-Rad),Varioskan LUX多功能酶標儀、FRESCO 21高速低溫離心機(美國Thermo Fisher),-80 ℃超低溫冰箱(日本SANYO),光學顯微鏡(日本Nikon)。

1.1.4 主要實驗試劑:水合氯醛、多聚甲醛(美國Sigma),放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液、二喹啉甲酸 (BCA)蛋白定量試劑盒(上海碧云天),大鼠TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(武漢華美生物),SIRT1抗體、兔抗SIRT1抗體(美國Proteintech)。

1.2 實驗方法 將60只大鼠隨機分為對照組、假手術組、模型組、右美托咪定低劑量組、右美托咪定高劑量組,每組各12只。大鼠體重達到(270±20)g時造模干預處理。術前禁食12 h不禁水,使用10%水合氯醛,以0.5 ml/100 g劑量將對照組以外的大鼠進行麻醉。手術過程中及術后注意對大鼠進行保溫,肛溫在(37±1)℃。對照組常規飼養,不進行造模干預。假手術組:切開頸部正中處皮膚后,鈍性分離皮下肌肉和主要血管,不進行模型制備,隨后縫合皮膚。其余各組采用Longa線栓法制備大腦中動脈栓塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。

大鼠麻醉后仰臥位固定,術前對大鼠頸前部皮膚進行消毒,在頸正中線處做2 cm切口,鈍性分離肌肉和筋膜,分離大鼠的右側頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)和頸外動脈(ECA),在ECA、CCA近心端結扎,在CCA遠心端處打活結,使用動脈夾暫時夾閉ICA,在CCA分叉5 mm處使用1 ml注射器針頭扎一小孔,將線栓經此插入CCA后將遠端活結拉緊以固定線栓,將線栓推入ICA后去除動脈夾,繼續推送線栓至有阻力感時停止,提示線栓到達大腦中動脈(MCA)處,檢查確認無活動性出血后,縫閉頸部皮膚,切口處消毒,大鼠單籠飼養。

血流栓塞共持續2 h,2 h后拔出線栓。在血流栓塞過程中,右美托咪定低劑量(25 μg/kg)、高劑量組(100 μg/kg)分別經腹腔注射右美托咪定,除對照組外,其余大鼠注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.2.1 MACO大鼠模型制備成功判斷標準:將大鼠尾部懸空提起,30 s內大鼠出現頸部轉動>10°,左前肢肌張力下降、屈曲內收,或爬行時出現追尾現象,即可視為造模成功。造模不成功的大鼠予以剔除。

1.2.2 腦組織標本的收集:所有大鼠經10%水合氯醛,以0.3 ml/100 g劑量麻醉后,立即斷頭處死并剝離腦組織。在冰上將腦組織皮質缺血半暗帶區域分離后,置于液氮中冷凍貯存備用。48 h后從液氮中取出樣本,置于-80 ℃冰箱中。

1.2.3 RT-PCR法檢測缺血腦組織SIRT1、NF-κB mRNA相對表達水平:使用Trizol法提取總RNA,稱取0.01 g腦組織,剪碎后加入Trizol裂解液并研磨,使組織充分裂解。加入裂解液后于冰上裂解15 min,反復吹打使細胞脫落后,將裂解液轉移至無酶EP管中。混勻靜置后加入1/5體積氯仿,再次混勻后4 ℃、12000 r/min離心15 min。吸取上清,加入異丙醇混勻后室溫靜置10 min,隨后于-20 ℃內靜置1 h。棄去上清后加入75%乙醇,再次4 ℃、12000 r/min離心15 min后,除去乙醇。隨后進行RNA定量,測定RNA濃度后進行逆轉錄合成cDNA。配置逆轉錄反應液,置于PCR儀中以37 ℃ 15 min -85 ～4 ℃ 10 min進行反應。隨后進行PCR實驗,95 ℃ 5 min,9 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,重復40次。以2-ΔΔCt法計算目的基因的表達量。引物設置如下:β-actin:上游:5’-CCCATCTATGAG-GGTTACGC-3’,下游:5’-TTTAATGTCACGCAC-GATTTC-3’;SIRT:上游:5’-TGTGTGTGGGTCTATG-CCTT-3’,下游:5’-CCTGCAATCCCAGGTACTTT-3’;NF-κB:上游:3’-CATCCACCATGGAAGACAAG-3’,下游:5’-CCAGCAGCATCTTCACATCT-3’。

1.2.4 Western blot法檢測缺血腦組織SIRT1、NF-κB蛋白表達水平:取適量的腦組織剪碎后放入EP管,加入裂解液后于冰上進行勻漿,4 ℃、12000 r/min離心30 min,吸取上層清液后,依據BCA試劑盒操作說明進行蛋白濃度測定。將配置好的蛋白標準品和PBS加入細胞板并繪制標準曲線,使用PBS將待測蛋白樣品稀釋,與BCA工作溶液混合后37 ℃孵育30 min,酶標儀測定樣品吸光度后繪制曲線測定蛋白濃度。蛋白變性后配置電泳凝膠,隨后上樣進行電泳,將3 μl預染蛋白Marker加入至孔道中,依次加入待測蛋白樣本。待膠液面分離后調整電泳時間,直至marker分開。隨后進行轉膜,將目的蛋白轉移至PVDF膜后,室溫下使用5%脫脂奶粉封閉1.5～2.5 h。將PVDF膜在一抗抗體(1∶1000)及內參β-actin(1∶2000)抗體溶液中浸泡,4 ℃孵育過夜。次日TBST洗膜后將PVDF膜在二抗溶液中浸泡,室溫下孵育1 h。TBST洗膜后,使用超敏發光液浸泡PVDF膜,使用化學發光成像系統進行顯影,并計算目的蛋白的相對表達水平。

1.2.5 大鼠海馬區炎性因子水平檢測:選用酶聯免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法測定大鼠海馬組織中的TNF-α、IL-6水平。將大鼠腦組織中雙側海馬仔細分離后,加入10倍的PBS溶液制成勻漿,4 ℃、5000 g離心5 min,取上層清液。將標準品加入96孔板前兩列中,每孔100 μl。將其余各孔內加入100 μl待測樣品,避光,37 ℃避光孵育90 min。加入100 μl抗體后,37 ℃孵育1 h,隨后洗板3次,加入酶結合物100 μl,37 ℃孵育30 min,甩干后重復洗滌5次。加入90 μl顯色底物,37 ℃孵育。加入終止液50 μl,使用酶標儀以波長450 nm處測量OD值,繪制標準曲線并計算測試樣品中的TNF-α、IL-6水平。

1.2.6 缺血腦組織氧化應激水平檢測:取各組大鼠缺血半暗帶處腦組織制備勻漿,使用丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)試劑盒進行檢測。依照操作說明書檢測樣本中SOD、MDA水平,使用酶標儀測定吸光度值后計算含量。

1.3 統計學方法 選擇SPSS 25.0統計學軟件對數據進行分析。計量資料以均數±標準差的形式表示,多組之間比較采用單因素方差分析,P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠缺血腦組織SIRT1、NF-κB mRNA 相對表達水平比較 結果表明,與對照組大鼠比較,Dex治療組大鼠SIRT1 mRNA水平降低、NF-κB mRNA水平升高,經Dex治療后兩組大鼠的SIRT1 mRNA水平升高,且Dex高劑量組更高;同時NF-κB mRNA水平下降,且Dex高劑量組低于Dex低劑量組,差異具有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠缺血腦組織SIRT1、NF-κB mRNA 相對表達水平比較

2.2 各組大鼠缺血腦組織SIRT1、NF-κB 蛋白表達水平比較 結果表明,與對照組大鼠比較,Dex治療組大鼠SIRT1 蛋白表達水平降低、NF-κB 蛋白水平升高,經Dex治療后兩組大鼠的SIRT1蛋白表達水平升高,且Dex高劑量組更高;同時NF-κB蛋白表達水平下降,且Dex高劑量組低于Dex低劑量組,差異具有統計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠缺血腦組織SIRT1、NF-κB蛋白相對表達水平比較

2.3 各組大鼠海馬區炎性因子TNF-α、IL-6水平比較 結果表明,與對照組、假手術組大鼠比較,其余各組大鼠TNF-α、IL-6水平升高,經Dex治療后兩組大鼠的炎性因子水平降低,且Dex高劑量組TNF-α、IL-6水平低于Dex低劑量組,差異具有統計學意義(均P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠海馬區炎性因子TNF-α、IL-6水平比較(pg/ml)

2.4 各組大鼠缺血腦組織MDA、SOD水平比較 結果表明,與對照組、假手術組大鼠比較,其余各組大鼠MDA水平升高、SOD水平下降,經Dex治療后兩組大鼠的MDA水平降低,Dex高劑量組更低,同時SOD水平升高,且Dex高劑量組更高,差異具有統計學意義(均P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠缺血腦組織MDA、SOD水平比較

3 討 論

腦卒中是引起患者死亡、致殘的主要疾病之一,其中缺血性腦卒中的比例在八成以上[2,7-8]。腦缺血發生后,腦組織發生一系列復雜的炎性反應、氧化應激反應、細胞凋亡等,也是引起腦梗死患者運動、感覺、言語、認知等功能障礙的病理機制。右美托咪定作為常用的鎮靜劑,臨床中常用于患者全麻插管時的麻醉及區域麻醉輔助鎮靜,能夠有效安撫患者的焦慮情緒。近年研究發現,Dex對多種器官的缺血損傷均有較好的保護作用[9]。研究表明,Dex可以通過調控Nfr2/HO-1通路減輕心肌損傷[10-11],同時可以通過緩解線粒體功能障礙導致的氧化應激繼而引起的腦組織受損。但針對Dex治療腦梗死的機制尚未完全明確,仍需進一步探究。MCAO模型是常用的誘導腦組織缺血模型,其誘發腦梗死的成功率較高;還可以實現對腦內血流阻塞/再灌注的精準控制,且引起的腦組織梗塞的面積更大,病理改變更為明顯[12]。但MCAO模型也有一定的局限性,插入的線栓僅能全部阻斷或恢復腦組織血運,與真實的腦梗死患者復雜的腦損傷情況仍有差異。

腦缺血發生后,缺血缺氧損傷和再灌注損傷會引起一系列的炎性反應,炎性因子被釋放至受損的腦組織部位,引起炎性浸潤[13]。炎性因子的積累會進一步激活炎癥相關通路,誘導更多炎性因子釋放,進一步加重神經細胞凋亡[14]。因此,抑制炎性相關通路的激活可有效緩解腦梗死后的腦組織損傷程度。SIRT1/NF-κB是重要的炎性反應調控通路,SIRT1在腦組織中含量較高,對維持神經系統的生理功能和代謝發揮重要作用,且SIRT1具有較好的抗炎功能[15]。而NF-κB與細胞炎性損傷密切相關,它可以通過產生促炎性因子TNF-α、IL-6等,進而加重炎性反應水平[16-17]。TNF-α、IL-6作為人體常用的炎性反應標志物,其含量與炎性反應程度呈正相關[18-19]。研究證實,SIRT1對NF-κB為負性調節作用,當SIRT1水平升高時,可以有效抑制NF-κB的炎性作用,緩解神經細胞損傷程度。本研究中,經Dex治療后,大鼠受損腦組織的SIRT1 mRNA和蛋白表達水平升高,NF-κB mRNA和蛋白表達水平以及海馬區TNF-α、IL-6水平下降,提示Dex可有效的通過上調SIRT1、下調NF-κB水平及其下游炎性因子的表達,有效抑制炎性反應,繼而發揮腦保護作用,且Dex高劑量組的治療效果優于低劑量組。活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)是有氧代謝的產物,適量的ROS可以有效促進腦組織的功能發育,而過量的ROS堆積則會產生氧化應激損傷,與腦卒中和其他神經退行性疾病密切相關[20-22]。生理狀態下,過量的ROS可被人體通過調節氧化還原和耗氧量而中和,當腦梗死發生后,ROS過量堆積無法清除,引起脂質和蛋白質過氧化,引起氧化應激反應,繼而引起神經元凋亡和變性死亡,加重腦損傷。相關研究表明,SIRT1可以通過誘導NF-κB、FOX家族蛋白等途徑,緩解衰老等疾病中的氧化應激反應水平,同時在動脈粥樣硬化、痛風性骨關節炎等疾病中也可通過激活SIRT1相關通路繼而緩解氧化應激[23-24]。SOD屬于抗氧化酶系統,是緩解超氧化物引起的氧化應激反應的關鍵物質,MDA是脂質氧化的終產物,通過破壞細胞中的核酸、酶、細胞器或生物膜等引起氧化應激損傷,MDA的含量可以有效反映腦組織的脂質過氧化程度,間接提示了神經元損傷程度[25]。本研究中,經Dex治療后,大鼠受損腦組織的SOD水平升高同時MDA水平下降,提示Dex可以有效改善受損腦組織的抗氧化應激能力,緩解氧化應激損傷,且Dex高劑量組的治療效果優于低劑量組。

綜上所述,右美托咪定可以有效緩解腦梗死發生后的腦組織損傷,發揮腦保護作用。其機制可能與激活SIRT1/NF-κB信號通路,進而減輕炎性反應、緩解氧化應激有關。