膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子/膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體信號(hào)通路在乳鼠先天性巨結(jié)腸相關(guān)性小腸結(jié)腸炎中的作用實(shí)驗(yàn)研究

牛志新,何 峰,宋春光,肖玉清

(1.秦皇島市第一醫(yī)院肛腸科,河北 秦皇島 066000;2.青龍滿(mǎn)族自治縣醫(yī)院外二科,河北 秦皇島 066500)

先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung’s disease,HD)是外科常見(jiàn)小兒消化道畸形,主要以結(jié)腸遠(yuǎn)段神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失引起便秘、腹脹及腸梗阻等為主要表現(xiàn)[1-2]。HD相關(guān)性小腸結(jié)腸炎(Hirschsprung-associated enterocolitis,HAEC)是HD常見(jiàn)并發(fā)癥,是導(dǎo)致HD患兒死亡的主要原因之一[3-4]。目前有關(guān)HAEC發(fā)病機(jī)制尚未明確,研究表明,免疫功能低下、腸黏膜屏障炎性損傷、菌群失調(diào)等均是影響HAEC發(fā)病的相關(guān)因素,但都不能完全解釋HAEC發(fā)生機(jī)制[5-6]。研究顯示,腸神經(jīng)系統(tǒng)改變?cè)贖AEC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7],但具體分子機(jī)制尚不十分清楚。膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF)是由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌的營(yíng)養(yǎng)因子,大量存在于胃腸道平滑肌中,其生物信息介導(dǎo)主要通過(guò)與其受體(GDNF family receptor alpha 1,GFRα1)、酪氨酸酶受體(Receptor tyrosine kinase,RET)協(xié)同作用促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)、保護(hù)腸黏膜,促進(jìn)腸道蠕動(dòng),對(duì)慢傳輸型便秘有一定改善作用[8-10]。目前有關(guān)GDNF/GFRα1信號(hào)通路在HAEC中的作用研究少見(jiàn)報(bào)道,因此本研究建立HAEC乳鼠模型,探討GDNF/GFRα1信號(hào)通路在HAEC中的作用,以期為完善HAEC病理生理過(guò)程有效治療HAEC提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 16只SPF級(jí)SD雌雄各半內(nèi)皮素受體B基因(Endothelin receptor B,Ednrb)敲除乳鼠(B6-129),體重18～26 g,平均(21.06±3.57)g,購(gòu)買(mǎi)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物合格批號(hào):SCXK(湖北)2014-0004]。

1.2 HD乳鼠模型建立及分組 鑒定出Ednrb基因敲除乳鼠基因后,篩選出雜合乳鼠,雜合乳鼠雜交獲得純合乳鼠。21日齡純合乳鼠為HD模型組(實(shí)驗(yàn)組),同日齡野生型乳鼠為對(duì)照組,8只/組。

1.3 腸道組織標(biāo)本采集 將21日齡的兩組乳鼠以脊髓脫臼法處死,取結(jié)腸組織沖洗干凈,依據(jù)腸管形態(tài)將實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本分為狹窄段、擴(kuò)張段,對(duì)照組標(biāo)本相應(yīng)分為遠(yuǎn)段、近段。每段標(biāo)本均分4部分,分別用于蘇木精-伊紅(HE)染色、酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assey,ELISA)檢測(cè)白介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α);免疫印跡(Wb)法蛋白檢測(cè)。

1.4 HE染色及HAEC判定 乳鼠結(jié)腸組織標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛固定、石蠟包埋、KH-Q350型病理組織切片機(jī)(購(gòu)自湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司)切片(6 μm厚)并脫蠟水化,進(jìn)行HE染色(試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司),以中性樹(shù)膠封片,OLYMPUS CX23型光學(xué)顯微鏡(購(gòu)自上海普赫光電科技有限公司)下觀察組織病理學(xué)變化,并拍照。腸道組織炎癥損傷程度采用Teitelbaum等[11]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估,病理評(píng)分≥Ⅲ級(jí)定為HAEC,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 ELISA法檢測(cè)結(jié)腸組織中IL-10、TNF-α水平檢測(cè) 將實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組組織標(biāo)本置于kimble微量組織勻漿器(購(gòu)自上海研卉生物科技有限公司)中,加入少量生理鹽水,充分勻漿,離心10 min(800 g),取上清。嚴(yán)格按照IL-10、TNF-α ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)(均購(gòu)自無(wú)錫云萃生物科技有限公司)測(cè)定IL-10、TNF-α水平。

1.6 結(jié)腸組織中GDNF/GFRα1通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用WB法測(cè)定結(jié)腸組織中GDNF/GFRα1通路相關(guān)蛋白表達(dá)。加入裂解液提取實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組結(jié)腸組織總蛋白,用BCA蛋白定量試劑盒(購(gòu)自北京伊塔生物科技有限公司)檢測(cè)蛋白濃度及純度。電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,加入兔抗鼠GDNF、GFRα1、RET、核轉(zhuǎn)錄因子κB p65(NF-κB p65)、TNF-α及內(nèi)參β-actin多克隆抗體(均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司)一抗,1∶500稀釋比,4 ℃過(guò)夜。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(購(gòu)自美國(guó)Abcam公司)(1∶1000)孵育2 h。曝光顯影、成像,采用Image J軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組乳鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化 實(shí)驗(yàn)組結(jié)腸狹窄段肌間、神經(jīng)叢未見(jiàn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,神經(jīng)叢顯著增厚且失去正常形態(tài);而擴(kuò)張段神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目增多、形態(tài)正常。對(duì)照組各腸段神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常、胞質(zhì)豐富、數(shù)量較多。炎癥損傷病理評(píng)分顯示:對(duì)照組乳鼠結(jié)腸遠(yuǎn)段、近段均為0級(jí);實(shí)驗(yàn)組8只乳鼠結(jié)腸狹窄段為Ⅱ級(jí)或以下,而擴(kuò)張段為Ⅲ級(jí)或以上為HAEC,說(shuō)明HAEC主要發(fā)生在結(jié)腸擴(kuò)張段。

2.2 兩組乳鼠結(jié)腸組織IL-10、TNF-α水平比較 對(duì)照組乳鼠結(jié)腸組織遠(yuǎn)段、近段IL-10、TNF-α水平比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05);實(shí)驗(yàn)組乳鼠結(jié)腸組織擴(kuò)張段IL-10水平顯著低于狹窄段,TNF-α水平顯著高于狹窄段(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組乳鼠結(jié)腸組織IL-10、TNF-α水平比較

2.3 兩組乳鼠結(jié)腸組織GDNF/GFRα1通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 對(duì)照組乳鼠結(jié)腸組織遠(yuǎn)段、近段GDNF、GFRα1、RET、NF-κB p65、TNF-α蛋白表達(dá)水平比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05);實(shí)驗(yàn)組乳鼠結(jié)腸組織擴(kuò)張段GDNF、GFRα1、RET蛋白表達(dá)均顯著低于狹窄段(均P<0.05),NF-κB p65、TNF-α蛋白表達(dá)均顯著高于狹窄段(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組乳鼠結(jié)腸組織GDNF/GFRα1通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3 討 論

HAEC是HD常見(jiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥,可發(fā)生在疾病任何時(shí)期,多出現(xiàn)腹脹、腹痛、高熱等,若未得到及時(shí)治療將給患兒生命帶來(lái)嚴(yán)重威脅[12]。目前有關(guān)HAEC病理生理機(jī)制尚未完全明確,臨床尚無(wú)確切治療方式,因此探究HAEC具體機(jī)制對(duì)其預(yù)防及治療有重要意義。

Ednrb基因敲除的純合乳鼠模型是研究HD腸炎發(fā)病機(jī)制的常用模型,表現(xiàn)為遠(yuǎn)端結(jié)腸細(xì)小、近端擴(kuò)張顯著,尤在乳鼠21日齡時(shí)表現(xiàn)明顯,且與野生型比較體重較輕。本研究HD模型建立成功并篩選出HAEC乳鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。研究表明腸神經(jīng)系統(tǒng)異常及炎癥反應(yīng)是HD主要發(fā)生原因[13-14]。IL-10是抗炎因子之一,由巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等產(chǎn)生,能夠通過(guò)抑制炎癥因子及其受體表達(dá)、活化發(fā)揮抗炎作用[15-16]。本研究顯示,與HAEC乳鼠結(jié)腸狹窄段比較,擴(kuò)張段IL-10水平顯著升高,與陳鋒等[17]研究結(jié)果一致,說(shuō)明結(jié)腸狹窄段與擴(kuò)張段炎癥反應(yīng)程度不同,可能與抗炎因子IL-10水平高低有關(guān)。

胃腸道蠕動(dòng)受腸神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié),腸壁內(nèi)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育依賴(lài)其神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的支持、維護(hù),其中GDNF是成熟腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)因子,GFRα1、RET是與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、遷移有關(guān)的功能因子,是神經(jīng)節(jié)發(fā)育主要的信號(hào)傳輸系統(tǒng)[18-19]。SORET[8]研究顯示,先天性直腸肛門(mén)畸形患兒的直腸末端中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子GDNF、GFRα1和RET水平異常低表達(dá)可能與直腸肛門(mén)畸形術(shù)后排便功能障礙關(guān)系密切。金曼等[20]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示,促進(jìn)GDNF/GFRα1/RET信號(hào)通路活化可對(duì)慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸組織發(fā)揮保護(hù)作用。既往研究顯示,GDNF與GFRα1結(jié)合形成復(fù)合物后,再與RET相互作用可激活磷脂肌醇3-激酶(Phosphatei-dylinositol 3 kinase,PI3K),活化產(chǎn)生第二信使PIP3,進(jìn)一步磷酸化蛋白激酶B(Serine-threonine kinase,AKT)蛋白的Thr308位點(diǎn),促使AKT活化,而活化的AKT發(fā)生磷酸化,抑制下游靶基因NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,而NF-κB是一種氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子,主要以p50/p65二聚體形式與其抑制蛋白(Inhibitor kappa,I-κB)形成復(fù)合體存在于正常細(xì)胞中,在細(xì)胞因子刺激下p50/p65二聚體與I-κB發(fā)生解離并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中,進(jìn)而調(diào)控多種炎性介質(zhì)如IL-6、TNF-α等的轉(zhuǎn)錄表達(dá),造成細(xì)胞DNA損傷或突變,促使炎癥反應(yīng)及進(jìn)展[21-23]。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示,促進(jìn)GDNF/PI3K/AKT信號(hào)通路激活可明顯改善功能性便秘乳鼠胃腸動(dòng)力,并減輕炎癥反應(yīng)[24-25]。本研究結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組乳鼠結(jié)腸組織擴(kuò)張段GDNF、GFRα1、RET蛋白表達(dá)均顯著低于狹窄段,NF-κB p65、TNF-α蛋白表達(dá)均顯著高于狹窄段,且炎癥較重,與既往相關(guān)研究結(jié)果一致,說(shuō)明HAEC乳鼠炎癥反應(yīng)主要發(fā)生在擴(kuò)張段,可能與GDNF/GFRα1/RET/NF-κB信號(hào)通路受抑制,腸神經(jīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)異常有關(guān)。

綜上所述,HAEC乳鼠結(jié)腸擴(kuò)張段炎癥相對(duì)較重,可能與GDNF/GFRα1信號(hào)通路及相關(guān)蛋白表達(dá)受抑制,腸神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)異常有關(guān),而具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步探究。