川芎嗪調控Wnt/β-連環蛋白信號通路對冠心病大鼠心肌細胞凋亡的機制研究

朱 靜,梁健球,劉寶驊

(佛山市第二人民醫院心內科,廣東 佛山 528000)

冠心病(Coronary heart disease,CHD)為一種臨床常見心血管疾病,指冠狀動脈狹窄、供血不足引起的心肌機能障礙和器質性病變,其發病機制較為復雜,臨床癥狀主要表現為心絞痛、呼吸短促、胸部壓迫等,近年來,CHD發病年齡趨于年輕化,發病率也呈明顯上升趨勢[1-2]。川芎嗪(Tetra methyl pyrazine,TMP)是一種提取自川芎的生物堿單體,化學結構為四甲基吡嗪,主要通過調節免疫/炎癥反應、細胞凋亡信號通路調控、血液循環、細胞脂質代謝等途徑發揮效用,臨床用于心、腦血管等疾病的治療已取得較好的療效[3-5]。Wnt是富含半胱氨酸的糖基化蛋白,與細胞分化、增殖、胚胎發育及成體組織的自身穩定等有關,Wnt通路配體和相應的細胞膜受體相互結合,可觸發至少三個不同的細胞內信號轉導級聯,包括:Wnt/β-連環蛋白(Wnt/β-catenin)、平面細胞極性通路、Wnt/Ca2+信號通路等[6-7]。心肌缺血、缺氧過程中心肌細胞伴隨著病理性凋亡和不可逆壞死,而Wnt/β-catenin 信號通路活性變化與心肌損傷的病因、發病基礎緊密相關[8-10]。基于此,本研究通過建立CHD大鼠模型,探討川芎嗪對細胞凋亡及Wnt/β-catenin信號通路的影響,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠50只,SPF級,體重180～200 g,購于西安交通大學實驗動物中心,動物飼養條件:溫度設定為20～23 ℃,濕度設定為60%～70%,明暗各12 h,正常飲水和攝食。

1.2 主要試劑和儀器 川芎嗪(上海信裕生物科技有限公司,貨號:XY21436);蘇木素-伊紅染色(HE)試劑盒、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(上海撫生實業有限公司,貨號:FS-10-17869、FS-79507);乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB) ELISA試劑盒(上海酶研生物科技有限公司,貨號:EK-R38005、EK-R38852、EK-R37496)、RIPA蛋白裂解液、總RNA提取、Trizol試劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海聯邁生物工程有限公司,貨號:LM3201-1、LM-21087R、LM0016、LM0012S);反轉錄試劑盒(雅吉生物,貨號:D1801XL);超聲成像系統(美國Beckman公司);實時熒光定量PCR儀、光學顯微鏡(日本 Olympus公司);Model 680 酶標儀、電泳儀(美國 Bio-Rad公司);多功能凝膠成像系統(美國Syngene公司)。

1.3 動物模型的制備及分組給藥 將50只SD大鼠按隨機數字表法分為五組,對照組和模型組以及川芎嗪低、中、高劑量組,各10只。對照組予以基礎飼料喂養6周。模型組、川芎嗪低劑量組、川芎嗪中劑量組、川芎嗪高劑量組參考文獻[7]制備冠心病大鼠模型,高脂飼料連續喂養6周,同時以10 ml/kg脂肪乳劑灌胃,6周測定大鼠心電圖,超聲提示T波高聳、心律不齊、ST段抬高>0.1 mV即為造模成功。建模成功后川芎嗪低、中、高劑量組大鼠依次腹腔注射50、100、200 mg/kg川芎嗪,其余兩組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水,五組均連續注射3周。

1.4 實驗方法

1.4.1 心功能檢測: 各組大鼠干預后用心臟彩色多普勒超聲檢測大鼠左心室射血分數(LVEF)、左心室收縮末期內徑(LVESD)、左心室舒張末期內徑(LVEDD)。

1.4.2 血清指標檢測: 各組大鼠給藥3周后,禁食12 h,腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉,開腹取大鼠腹主動脈血,血液標本靜置1 h后,行3000 r/min離心10 min,收集上清液保存于-70 ℃待測,酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清LDH、CK、CK-MB水平。

1.4.3 HE染色:麻醉處死大鼠,摘除心臟,以4%多聚甲醛對部分心肌組織固定,依次進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟等步驟,行蘇木素-伊紅染色再封片(中性樹膠),放于光學顯微鏡下觀察心肌組織結構變化。

1.4.4 TUNEL檢測心肌細胞凋亡:將心肌組織石蠟切片先脫蠟和水化,再用PBS緩沖液沖洗2次,蛋白酶K處理15 min,2% H2O2處理5 min,經PBS沖洗2次,加TUNEL反應液37 ℃避光30 min,PBS清洗3次后,DAB顯色,蘇木精復染后封片干燥,每張切片隨機取5個視野,熒光顯微鏡下觀察,陽性細胞為綠色。

1.4.5 RT-qPCR檢測Wnt3a、β-catenin mRNA表達:取大鼠剩余心肌組織,研磨破碎,總RNA以Trizol法提取,并取2 μg RNA行逆轉錄后并擴增,引物序列:Wnt3a上游5’-CGGGTTCTTCTCTGGTCCTTG-3’,下游5’-CTGACAGTGGTGCAGTTCCA-3’;β-catenin上游5’-AAGTTCTTGGCTATTACGACA-3’,下游5’-ACAGCACCTTCAGCACTCT-3’;內參GAPDH上游5’-GACCACTTTGTCAAGCTCTATTTCC-3’,下游5’-GTGAGGGTCTCTCTTCCTCTTGT-3’,擴增于常規條件下展開,經40個循環后,利用凝膠成像儀獲取圖片,2-ΔΔCt對樣本基因進行表達差異相對定量分析。

1.4.6 Western blot檢測各組大鼠心肌組織中Wnt3a、β-catenin蛋白表達:取大鼠剩余心肌組織,加入裂解液,12000 r/min離心10 min 后取上清液,BCA檢測蛋白濃度,加蛋白緩沖液使其變性,上樣10 μg電泳,將電泳分離得到的樣本,移到PVDF膜上固定,并封閉2 h(10%山羊血清),先一抗孵育過夜(4 ℃)后,加二抗(常溫)孵育2 h,選GAPDH為內參,經洗膜、顯色后,成像拍照后做灰度值統計分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠心功能比較 模型組大鼠LVEF%低于對照組和川芎嗪低、中、高劑量組,LVESD、LVEDD高于對照組和川芎嗪低、中、高劑量組,差異有統計學意義(均P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠心功能比較

2.2 各組大鼠血清LDH、CK、CK-MB水平比較 對照組血清LDH、CK、CK-MB水平低于模型組和川芎嗪低、中、高劑量組,模型組大鼠血清LDH、CK、CK-MB水平高于對照組和川芎嗪低、中、高劑量組,差異有統計學意義(均P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠血清LDH、CK、CK-MB水平比較(U/L)

2.3 HE染色 對照組心肌細胞大小均等,心肌纖維無腫脹、排列緊密;模型組心肌纖維呈現明顯腫脹、斷裂,細胞排列無規則,并有大量炎癥細胞浸潤;川芎嗪低、中、高劑量組心肌損傷逐漸改善,細胞水腫變性減少,僅少量炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組心肌細胞HE染色(HE染色,×400)

2.4 TUNEL檢測心肌細胞凋亡 TUNEL檢測結果顯示,細胞凋亡顯示綠色熒光,對照組心肌細胞凋亡較少,模型組心肌細胞凋亡率較川芎嗪低、中、高劑量組高,川芎嗪高劑量組細胞凋亡率低于模型組和低、中劑量組,差異有統計學意義(均P<0.05),見圖2、3。

圖2 各組心肌細胞凋亡檢測結果(TUNEL染色,×400)

注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與川芎嗪低劑量組比較,△P<0.05;與川芎嗪中劑量組比較,▲P<0.05

2.5 RT-qPCR檢測各組Wnt3a、β-catenin mRNA表達 qRT-PCR檢測結果顯示,模型組心肌組織中Wnt3a、β-catenin mRNA表達高于對照組,川芎嗪高劑量組心肌組織中Wnt3a、β-catenin mRNA表達低于低、中劑量組,比較差異有統計學意義(均P<0.05),見圖4。

注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與川芎嗪低劑量組比較,△P<0.05;與川芎嗪中劑量組比較,▲P<0.05

2.6 Western blot檢測各組大鼠心肌組織中Wnt3a、β-catenin蛋白表達 Western blot檢測結果顯示,模型組心肌組織中Wnt3a、β-catenin 蛋白表達高于對照組,川芎嗪高組心肌組織中Wnt3a、β-catenin 蛋白表達低于低、中劑量組(均P<0.05),見圖5。

注:A圖為心肌組織中Wnt3a、β-catenin蛋白表達;B圖為心肌組織中Wnt3a、β-catenin蛋白表達比較與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與川芎嗪低劑量組比較,△P<0.05;與川芎嗪中劑量組比較,▲P<0.05

3 討 論

冠心病為常見的缺血性心臟病,病理基礎為動脈粥樣硬化(AS),主要是血管內皮暴露在致病因素如高血糖、高血壓、修飾脂蛋白等條件下,引起內皮細胞損傷和功能障礙、血管壁彈性減弱、炎癥介質釋放,血管平滑肌細胞增殖等情況,使得冠脈狹窄或阻塞,造成心肌缺血、缺氧或死亡,是造成心肌細胞死亡的主要形式之一[11-14]。

川芎嗪有廣泛的藥理活性,能通過減輕細胞內鈣離子超載、解除血管平滑肌痙攣、清除氧自由基、促進心肌細胞能量代謝等途徑擴張冠脈,增加冠脈血流量,改善心肌缺氧,保護心肌細胞及心肌缺血再灌注損傷,廣泛應用于心腦血管疾病的治療[15-17]。本研究通過高脂飲食聯合脂肪乳劑灌胃建立CHD大鼠模型,并以川芎嗪干預發現,川芎嗪低、中、高劑量組治療后大鼠心功能和心肌損傷均出現好轉,川芎嗪低、中、高劑量組大鼠血清LDH、CK、CK-MB水平均下降,模型組大鼠LVEF%低于川芎嗪低、中、高劑量組,LVESD、LVEDD高于川芎嗪低、中、高劑量組,HE染色結果顯示,心肌纖維呈現明顯腫脹、斷裂,細胞排列無規則,并有大量炎癥細胞浸潤,川芎嗪低、中、高劑量組心肌損傷逐漸改善,細胞水腫變性減少,僅少量炎性細胞浸潤,川芎嗪高劑量組細胞凋亡率低于模型組和低、中劑量組,提示川芎嗪能緩解心肌損傷,改善心臟功能。心肌缺血及缺氧及壞死后,鈣超載及自由基大量產生,引起了脂質過氧化反應,干擾多生物膜的結構及功能,使細胞內一系列酶與蛋白質進入全身血液循環中[18-20]。川芎嗪作用機理為川芎嗪能使內源性超氧化物歧化酶的活性提高,更為有效的清除氧自由基,減輕細胞內鈣離子超載,緩解心肌細胞的損害,保證細胞膜的完整性,心肌細胞中酶分子的基處于還原狀態,維持了酶的正常活性,LDH、CK、CK-MB水平下降[21-23]。劉英等[24]證實了,CHD大鼠經TMP和西藥的灌胃后CK、CK-MB水平均下降。王顯鳳等[25]也發現,川芎嗪注射液通過激活Notch通路減少心肌細胞凋亡,并抑制氧化應激反應,改善心臟功能。

血管內皮的損傷和功能障礙是AS發生的始動環節,AS是CHD發生的病理基礎,Wnt/β-catenin通路參與調控血管內皮細胞的功能發生和穩態維持[26-30]。在本研究中,模型組心肌組織中Wnt3a、β-catenin mRNA和蛋白表達低于正常組,川芎嗪高劑量組Wnt3a、β-catenin mRNA和蛋白表達高于低、中劑量組,初步說明川芎嗪可能通過抑制Wnt/β-catenin通路激活減輕心肌損傷,減少心肌細胞凋亡。謝駿等[31]證實,上調心肌缺血再灌注損傷模型大鼠CTRP9表達能進一步抑制心肌細胞的凋亡,使Wnt3a、β-catenin、p38MAPK下降,機制可能與調控Wnt/β-catenin通路有關。何佳等[32]發現,補腎活血復方組及賴諾普利組LVEDD、LVESD、Wnt3a、β-catenin蛋白及mRNA表達顯著下調,可通過抑制Wnt信號通路抑制大鼠心肌損傷及細胞凋亡。馬彥娟等[33]證實,miR-124-3p抑制劑可有效敲低模型心肌細胞中Wnt1與β-catenin的表達,減少心肌細胞的凋亡、細胞損傷及炎性因子的釋放。以上結果說明Wnt/β-catenin信號通路參與CHD發生、發展[34-35]。

綜上所述,川芎嗪能改善大鼠心肌細胞的凋亡,減輕細胞損傷,其機制可能與調節Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達有關。