細(xì)顆粒物致人肺泡上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)關(guān)鍵組分及機(jī)制探究

王 榮,張邱棟,張懿燁,賀紅梅,王娜娜,秦 蓓

(1.西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,陜西 西安 710021;2.西安市多靶協(xié)同抗高血壓創(chuàng)新藥物研制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710021;3.西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院,陜西 西安 710021)

可吸入顆粒物(Particulate matter,PM)是城市首要空氣污染物,是大氣污染的關(guān)鍵成分,PM2.5表示空氣動(dòng)力學(xué)當(dāng)量直徑≤ 2.5 μm的懸浮顆粒物,又稱細(xì)顆粒物(Particulate matter 2.5,PM2.5)[1]。PM2.5粒徑小,可通過呼吸進(jìn)入呼吸道深處和肺部,沉積于肺泡,引發(fā)一系列肺部病變,影響肺部功能,其與呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和病死率密切相關(guān)[2-4]。已有研究表明,PM2.5誘發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病與其致毒組分有關(guān)[5-6]。

A549是人肺腺癌上皮細(xì)胞,其在體外培養(yǎng)過程中呈現(xiàn)出Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的特征[7],是目前評(píng)價(jià)PM2.5對(duì)呼吸系統(tǒng)危害的常用細(xì)胞模型[8]。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路是胞內(nèi)一組進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,能感受胞外刺激調(diào)節(jié)細(xì)胞多種生理過程[9]。已有文章報(bào)道了PM2.5全組分對(duì)A549細(xì)胞存活的影響[10-11],但未揭示PM2.5組分-效應(yīng)間的關(guān)系。本研究將PM2.5樣本的不同組分暴露于A549細(xì)胞,檢測其對(duì)細(xì)胞存活和炎癥指標(biāo)的影響,研究MAPK信號(hào)通路及糖皮質(zhì)激素對(duì)PM2.5不同組分導(dǎo)致的炎癥是否具有干預(yù)作用,初步甄別PM2.5誘導(dǎo)呼吸系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的可能毒性組分,為控制典型區(qū)域PM2.5污染和提高人群健康保障提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 人Ⅱ型肺泡上皮A549細(xì)胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫);PM2.5樣品(西安交通大學(xué)能源與動(dòng)力工程學(xué)院沈振興教授饋贈(zèng),采集于2019年3月,采集地點(diǎn)位于西安交通大學(xué)能源與動(dòng)力工程學(xué)院15 m高建筑物樓頂,PM2.5樣品濃度192.97 μg/m3);無血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基(RPMI) 1640培養(yǎng)基(美國HyClone公司);青鏈霉素混合液、胰酶細(xì)胞消化液(Biosharp公司);胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司);四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT,Sigma公司);酶聯(lián)免疫試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司);MAPK信號(hào)通路抑制劑(Med Chem Express USA)。

1.2 PM2.5不同組分工作液的制備 稱取40 mg PM2.5粉末,分別加入二甲基亞砜(DMSO)和二氯甲烷 1 ml,超聲震蕩20 min,連續(xù)3次,0.22 μm 無菌濾膜在超凈臺(tái)濾過,揮干,分別再加入200 μl DMSO的濃度200 mg/ml的全顆粒物(Whole particles of PM2.5,WPPM2.5)和脂溶性組分(Liposoluble-soluble PM2.5,LSPM2.5)母液。另稱取40 mg PM2.5粉末,加超純水1 ml,超聲震蕩20 min,連續(xù)3次,過濾,干燥,稱重,制備濃度200 mg/ml 的水溶性組分(Water-soluble PM2.5,WSPM2.5)母液。分別取上述母液0.5～5 μl,加培養(yǎng)基2 ml得到50、100、200、300、400、500 μg/ml的工作液。4 ℃ 保存,備用。

1.3 PM2.5對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 采用RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10 %的胎牛血清,1 %的青鏈霉素)于37 ℃,5% CO2條件下培養(yǎng)A549細(xì)胞。不同濃度PM2.5工作液與A549細(xì)胞培養(yǎng)24 h,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 MTT法檢測PM2.5對(duì)A549增殖的影響 對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞,以1.2×104/孔的密度接種于96孔板中培養(yǎng)24 h。棄上清,分別將上述組分不同濃度的工作液以100 μl /孔加入培養(yǎng)板,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組。培養(yǎng)12～48 h后棄去上清,每孔加入100 μl 0.5 mg/ml MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去上清后每孔加入150 μl DMSO,震搖10 min,490 nm處酶標(biāo)儀檢測吸光度(OD值),計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5 MAPK信號(hào)通路抑制劑及地塞米松對(duì)PM2.5抑制A549增殖的影響 細(xì)胞接種同1.4。200 μg/ml的PM2.5不同組分工作液以100 μl/孔加入孔板。實(shí)驗(yàn)分為空白組、PM2.5組、PM2.5+抑制劑組(ERK通路抑制劑U0126、p38通路抑制劑SB203580、JNK通路抑制劑SP600125和地塞米松)。為了考察抑制劑的作用濃度和時(shí)間,U0126、SB203580和SP600125的作用濃度設(shè)置為10-4或2×10-4mol/L,地塞米松作用濃度設(shè)置為10-5或2×10-5mol/L,培養(yǎng)時(shí)間為24～48 h。按1.3操作MTT法檢測細(xì)胞存活率。

1.6 細(xì)胞上清液中炎性因子的檢測 細(xì)胞接種同1.4。200 μg/ml的PM2.5不同組分暴露基礎(chǔ)上加入U(xiǎn)0126、SB203580、SP600125(2×10-4mol/L)和地塞米松(2×10-5mol/L)處理細(xì)胞48 h,收集細(xì)胞上清,ELISA檢測白細(xì)胞介素-6(IL-6),IL-8,腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。

1.7 細(xì)胞信號(hào)通路磷酸化水平的檢測 細(xì)胞接種同1.4,設(shè)置對(duì)照組和PM2.5不同分組,分別培養(yǎng)30 min、1、24 h后收集細(xì)胞上清液。ELISA檢測細(xì)胞信號(hào)通路磷酸化水平。

2 結(jié) 果

2.1 PM2.5不同組分對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)的影響 結(jié)果見圖1。A549細(xì)胞呈長梭形或圓形,貼壁良好。WSPM2.5組細(xì)胞形態(tài)、密度與對(duì)照組相似;LSPM2.5及WPPM2.5組細(xì)胞與對(duì)照組相比明顯皺縮,多呈圓形,且隨著濃度的增加,活細(xì)胞數(shù)目逐漸減少。

2.2 PM2.5不同組分對(duì)A549 細(xì)胞增殖的影響 如圖2所示,WPPM2.5及LSPM2.5可顯著降低A549細(xì)胞活性,隨工作濃度的增加,WPPM2.5及LSPM2.5對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用呈濃度和時(shí)間依賴性。WSPM2.5不管是時(shí)間變化還是濃度變化均對(duì)A549增殖沒有明顯的抑制作用。IC50值如表1所示,培養(yǎng)24 h后完全組分IC50為199.9 μg/ml、脂溶性組分IC50為142.1 μg/ml。

表1 PM2.5不同組分抑制A549細(xì)胞增殖的IC50(μg/ml)

圖2 PM2.5不同組分培養(yǎng)12～48 h對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響

2.3 MAPK信號(hào)通路抑制劑及地塞米松對(duì)PM2.5抑制A549增殖的影響 通過將MAPK信號(hào)通路抑制劑及地塞米松與200 μg/ml PM2.5不同組分共同培養(yǎng)篩選抑制劑及地塞米松的最佳作用濃度和時(shí)間。結(jié)果顯示,2×10-4mol/L抑制劑和2×10-5mol/L地塞米松作用24 h,與PM2.5組相比,MAPK信號(hào)通路抑制劑(U0126、SB203580、SP600125)和地塞米松均可顯著降低A549細(xì)胞存活率,增強(qiáng)WPPM2.5和LSPM2.5對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用(P<0.05或P<0.01);WSPM2.5對(duì)A549細(xì)胞增殖無顯著影響,但MAPK信號(hào)通路抑制劑和地塞米松亦可降低A549細(xì)胞的存活率(均P<0.05)。見圖3。

注:A為抑制劑(10-4mol/L)和地塞米松(10-5mol/L)作用24 h;B為抑制劑(10-4mol/L)和地塞米松(10-5mol/L)作用48 h;C為抑制劑(2×10-4mol/L)和地塞米松(2×10-5mol/L)作用24 h。與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與PM2.5組比較,#P<0.05,##P<0.01

2.4 PM2.5致A549細(xì)胞炎癥反應(yīng)的檢測 我們進(jìn)一步評(píng)價(jià)了WPPM2.5和LSPM2.5對(duì)炎癥因子釋放的影響及機(jī)制。圖4A為細(xì)胞上清液中IL-6因子水平,LSPM2.5可顯著提高IL-6水平,U0126、SB203580、SP600125和地塞米松均可顯著降低LSPM2.5染毒細(xì)胞上清液中IL-6水平(均P<0.01)。圖4B為IL-8因子水平,WPPM2.5和LSPM2.5可顯著增加IL-8表達(dá),U0126、SB203580、SP600125和地塞米松均可顯著抑制WPPM2.5和LSPM2.5致IL-8表達(dá)的增加(均P<0.01)。圖4C為TNF-α因子水平,MAPK通路抑制劑及地塞米松對(duì)TNF-α水平無顯著影響。

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與PM2.5組比較,#P<0.05,##P<0.01

2.5 PM2.5不同成分對(duì)A549細(xì)胞MAPK信號(hào)通路表達(dá)的影響 200 μg/ml WPPM2.5和LSPM2.5與A549細(xì)胞共同培養(yǎng),ELISA法檢測MAPK信號(hào)通路的活化水平。與對(duì)照組相比,作用30 min和1 h,WPPM2.5和LSPM2.5組p-ERK1/2與ERK1/2比值均顯著增加(P<0.05或P<0.01)。作用24 h,WPPM2.5和LSPM2.5可顯著增加p-JNK/JNK表達(dá)(均P<0.05),WPPM2.5和LSPM2.5對(duì)P38信號(hào)通路無顯著影響。見圖5。

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01

3 討 論

PM2.5因其污染源多樣而呈現(xiàn)出組分復(fù)雜的特點(diǎn)。研究顯示,PM2.5暴露對(duì)人體的損害與PM2.5濃度、粒徑和化學(xué)組分有關(guān),不同組分對(duì)機(jī)體健康的不良效應(yīng)及機(jī)制存在差異[12-13]。炎癥是機(jī)體對(duì)吸入PM2.5的早期反應(yīng),PM2.5暴露可導(dǎo)致以炎性因子釋放和炎癥細(xì)胞浸潤為特征的炎癥反應(yīng)[14-18]。然而,PM2.5誘導(dǎo)炎癥的關(guān)鍵組分仍不清晰。因此,本研究采用西安冬季大氣PM2.5。西安屬于顆粒物污染嚴(yán)重的汾渭平原區(qū)域,其PM2.5主要來自于汽車尾氣和燃煤燃燒,PM2.5樣本具有一定代表性。

PM2.5主要由水溶性無機(jī)離子、金屬元素、碳組分、多環(huán)芳烴等成分組成,水溶性無機(jī)離子與金屬元素是水溶性組分的主要構(gòu)成,碳組分與多環(huán)芳烴是脂溶性組分的主要構(gòu)成。本研究采用超純水和二氯甲烷分別提取PM2.5水溶性和脂溶性組分,另采用DMSO制備PM2.5全顆粒樣品,對(duì)比三類組分對(duì)A549細(xì)胞存活及對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響。對(duì)細(xì)胞存活能力的影響是評(píng)價(jià)顆粒物對(duì)細(xì)胞毒性效應(yīng)的重要指標(biāo)。結(jié)果顯示,PM2.5全顆粒和脂溶性組分可明顯抑制A549細(xì)胞的增殖,并呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性,且二者暴露均可顯著增加炎癥因子的表達(dá)。對(duì)比二者的IC50值,全顆粒組分的IC50值(199.9 μg/ml)大于脂溶性組分的IC50值(142.1 μg/ml),表明脂溶性組分對(duì)A549細(xì)胞的毒性較大,而水溶性組分對(duì)細(xì)胞存活無顯著影響。

MAPK信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo),包括細(xì)胞增殖、分化、死亡過程及炎癥因子分泌等[19-22]。研究發(fā)現(xiàn),PM2.5可激活MAPK信號(hào)通路引發(fā)氣道炎癥[23]。糖皮質(zhì)激素是目前廣泛使用的抗炎藥物,因此,我們選擇MAPK信號(hào)通路特異性抑制劑及地塞米松探討了PM2.5不同組分影響A549細(xì)胞活性和炎癥的影響。MAPK信號(hào)通路抑制劑和地塞米松可顯著增強(qiáng)PM2.5全顆粒和脂溶性組分對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用,抑制炎性因子的表達(dá)。PM2.5全顆粒和脂溶性組分促進(jìn)了JNK和ERK1/2的磷酸化。提示PM2.5全顆粒和脂溶性組分可明顯抑制A549細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)炎癥,其機(jī)制可能與激活ERK1/2和JNK MAPK信號(hào)通路有關(guān)。