仔豬副豬嗜血桿菌的分離鑒定及耐藥性檢測

陳新湖

(湖南省衡陽市祁東縣金橋鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，湖南衡陽 421600）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,Hps）為臨床中常見的條件性致病菌之一，該菌廣泛存在于自然界的養(yǎng)殖環(huán)境中，還存在于豬的上呼吸道中，尤其是在養(yǎng)豬過程中，如果飼養(yǎng)管理不當(dāng)、應(yīng)激（如天氣驟變、轉(zhuǎn)群、運輸）等導(dǎo)致豬的免疫力下降，容易引發(fā)副豬嗜血桿菌病[1-3]。副豬嗜血桿菌具有多種血清型，可以感染不同階段的豬只，尤其是對4～8 周齡的仔豬最易感，其感染率和死亡率均較高，臨床中以呼吸困難、纖維素性胸膜炎、肺炎及關(guān)節(jié)炎等多種癥狀最常見，經(jīng)常與免疫抑制性疾病如豬圓環(huán)病毒病、豬瘟、豬藍耳病等混合感染，可以導(dǎo)致豬的高感染率和高死亡率[4-7]。仔豬副豬嗜血桿菌病在世界多個國家和地區(qū)流行，該病已經(jīng)成為危害養(yǎng)豬業(yè)的重要細(xì)菌性傳染病之一[8-10]。國內(nèi)外相關(guān)研究表明，仔豬副豬嗜血桿菌病主要通過抗生素進行治療，由于該病流行廣泛，其耐藥性已經(jīng)普遍存在且呈現(xiàn)逐年增高的趨勢，細(xì)菌的耐藥性給臨床用藥帶來了一定困難，同時抗生素的使用也危害著人們的健康，藥物殘留已成為公共衛(wèi)生安全的主要問題[11-12]。本試驗對采集患病仔豬病料樣品進行Hps 分離鑒定，并檢測副豬嗜血桿菌的致病性和耐藥性，以期為該地區(qū)仔豬Hps 合理用藥提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 菌株來源

2021年采集的衡陽祁東地區(qū)不同規(guī)模化養(yǎng)豬場及散養(yǎng)戶中患呼吸道病死仔豬口鼻拭子、胸腔積液、肺臟等病料組織187 份，將采集的樣品進行處理后，進行副豬嗜血桿菌的分離鑒定。

1.2 細(xì)菌分離與培養(yǎng)

將采集的樣品進行處理后，在無菌條件下，接種于巧克力培養(yǎng)基上，在厭氧環(huán)境條件下（5% CO2培養(yǎng)箱中）37℃恒溫培養(yǎng)12～18 h 后，挑取單個菌落接種于TSB 培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)12～18 h，進行革蘭氏染色、鏡檢觀察其形態(tài)學(xué)。

1.3 衛(wèi)星現(xiàn)象檢測

參照王同兆等[13]報道的方法，將純化的分離菌株在無菌條件下接種于7%脫纖綿羊血平板上，再在7%脫纖綿羊血平板上的中心進行垂直劃線接種金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CVCC2523），在厭氧環(huán)境條件下（5% CO2培養(yǎng)箱中）37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h 后，觀察7%脫纖綿羊血平板上分離菌株的菌落是否有衛(wèi)星菌落生長與溶血現(xiàn)象。

1.4 細(xì)菌PCR 鑒定

參考王慶云[14]的研究方法，設(shè)計鑒定副豬嗜血桿菌所需的引物，在華大基因合成引物（表1）。采用煮沸法提取具有衛(wèi)星菌落現(xiàn)象的分離菌株的基因組，并進行PCR 鑒定?；厥誔CR 產(chǎn)物，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序與比對。

表1 引物序列

1.5 致病性試驗

參考王麗榮等[15]的方法，將分離菌株接種于營養(yǎng)肉湯中，培養(yǎng)至對數(shù)期調(diào)整菌液濃度為109CFU/mL，每株分離菌株經(jīng)腹腔注射給5 只昆明系小鼠，劑量為0.5 mL/只（109CFU/mL），對照組小鼠注射等量的無菌生理鹽水。試驗期7 d，觀察小鼠的發(fā)病情況。

1.6 藥敏試驗

分離菌株的藥敏試驗參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）2013年推薦的藥敏試驗法標(biāo)準(zhǔn)進行操作與結(jié)果判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

疑似副豬嗜血桿菌的菌株通過巧克力培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)及鏡檢，觀察其形態(tài)學(xué)結(jié)果（圖1），均符合副豬嗜血桿菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)學(xué)。

圖1 分離菌株革蘭氏染色（1 000×）

2.2 衛(wèi)星現(xiàn)象檢測

將純化的分離菌株在無菌的條件下接種于7%脫纖綿羊血平板上，進行副豬嗜血桿菌衛(wèi)星現(xiàn)象檢測。結(jié)果顯示，分離菌株生長狀態(tài)良好，出現(xiàn)了典型的“衛(wèi)星現(xiàn)象”，分離菌株沒有出現(xiàn)溶血現(xiàn)象（圖2）。

圖2 分離菌株的衛(wèi)星現(xiàn)象

2.3 細(xì)菌PCR 鑒定

對出現(xiàn)了典型“衛(wèi)星現(xiàn)象”的分離菌株進行PCR鑒定。結(jié)果顯示分離的78 株分離菌株均擴增出大約為821 bp 的目的條帶（圖3）。經(jīng)序列對比78 株分離菌株與參考株（副豬嗜血桿菌）的同源性均大于97.9%，說明分離株為副豬嗜血桿菌，分離率為41.7%（78/187）。

圖3 分離的副豬嗜血桿菌菌株P(guān)CR 鑒定結(jié)果

2.4 致病性試驗

攻毒組小鼠在攻毒后2～3 d 出現(xiàn)了不同程度的發(fā)病，且個別攻毒的小白鼠不表現(xiàn)任何癥狀，而出現(xiàn)急性死亡，剖檢死亡小鼠可見其肺臟、肝臟、腎臟、脾臟出現(xiàn)了不同程度的出血。通過病料組織分離培養(yǎng)，得到了副豬嗜血桿菌，攻毒試驗結(jié)束對照組小鼠健康存活。經(jīng)統(tǒng)計，50 株副豬嗜血桿菌能引起小白鼠的死亡，且分離出的菌株均為致病性副豬嗜血桿菌。

2.5 藥敏試驗

由表2 可知，分離的50 株致病性副豬嗜血桿菌對青霉素、阿莫西林、氨芐西林等8 種藥物的耐藥率為44.0%～50.0%，對頭孢噻呋、頭孢噻肟、替米考星等6種藥物的耐藥率為4.0%～44.0%；說明臨床中分離的50 株致病性副豬嗜血桿菌對常用的治療豬呼吸系統(tǒng)疾病的藥物有不同程度的耐藥性。

表2 藥敏試驗結(jié)果

3 討論

副豬嗜血桿菌為養(yǎng)豬業(yè)常見的條件性致病菌，該菌廣泛存在于養(yǎng)殖環(huán)境中和健康豬只的體內(nèi)，可以通過多種途徑（直接接觸傳播、空氣傳播、飼料飲水傳播等）在不同豬只之間傳播[2]。副豬嗜血桿菌病可引起豬只發(fā)病，急性病例呈現(xiàn)呼吸困難、急性敗血癥等，具有發(fā)病比較急、死亡率較迅速等特點，為養(yǎng)豬業(yè)中常見的急性、敗血性疫病[6]。近年來，關(guān)于仔豬副豬嗜血桿菌病的報道越來越多，尤其對仔豬的危害較大，同時在臨床中，常常發(fā)現(xiàn)與其他致病菌（毒）混合感染。本試驗從衡陽祁東地區(qū)不同規(guī)?；B(yǎng)豬場及散養(yǎng)戶中采集的187 份病料樣品中，分離到50 株致病性副豬嗜血桿菌，說明副豬嗜血桿菌在該地區(qū)豬場中流行嚴(yán)重，可能對仔豬存在潛在危害性，尤其豬場應(yīng)注意副豬嗜血桿菌病的防控，同時注意環(huán)境衛(wèi)生，加強飼養(yǎng)管理，注意對該菌進行合理疫苗免疫。

臨床中，仔豬副豬嗜血桿菌主要通過抗菌藥物進行防治，隨著抗菌藥物的不合理使用、甚至濫用，導(dǎo)致細(xì)菌對部分抗菌藥物產(chǎn)生較強的耐藥性，且耐藥性菌株不斷出現(xiàn)，同一地區(qū)不同養(yǎng)殖場，其細(xì)菌的耐藥性也存在差異性，嚴(yán)重影響藥物對該病的治療效果[7,10,11,14]。因此，在臨床中治療該病時，應(yīng)做好藥敏試驗，選擇對副豬嗜血桿菌敏感的藥物進行交替使用，同時應(yīng)該配合環(huán)境消毒。

4 小結(jié)

從采集的187 份病料樣品中分離到了50 株致病性菌株副豬嗜血桿菌，50 株致病性副豬嗜血桿菌對青霉素、阿莫西林、氨芐西林等8 種藥物的耐藥率在44.0%～50.0%之間，對其他藥物的耐藥率為4.0%～44.0%，為該地區(qū)仔豬副豬嗜血桿菌病的合理用藥及防控提供參考。