仔豬源鏈球菌分離鑒定與耐藥性試驗

王曉艷

(山東省莒南縣檢驗檢測中心，山東臨沂 276600）

鏈球菌（Streptococcus）是臨床中常見的人畜共患病原菌之一，該菌廣泛存在于自然界的土壤、水源及養殖環境中，且大多數的健康動物體內也存在該細菌[1]。鏈球菌可以感染多種家畜（豬、牛、羊、鹿）、家禽（雞、鴨、鵝）甚至感染人，并引起畜禽發病，該菌可以引起多種動物和人的敗血癥、腦膜炎、關節炎、肺炎、乳房炎、腹瀉、化膿及毒素引起的休克等一系列的臨床癥狀，同時該菌可以引起人患病，嚴重危害著動物和人類健康，因此，臨床上對該病的防控具有重要意義[2,3]。豬鏈球菌病是嚴重危害養豬業的細菌性疾病之一，該病是由不同血清型的鏈球菌引起的，對各個階段的豬只均有感染，其中對仔豬危害較大，臨床上多以急性癥狀中的腦膜炎、敗血癥、心內膜炎和慢性癥狀的關節炎為常見，其感染率和死亡率均較高，死亡率高達80%以上，且在臨床中經常與病毒性疾病（豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環病毒2 型）混合感染，給全球養豬業帶來嚴重的經濟損失[4-7]。

近年來，對于豬鏈球菌病的報道越來越多，鏈球菌可以感染不同階段的豬，其中對仔豬最易感，尤其4～10日齡仔豬，臨床中以肺炎、化膿性感染、滲出性皮炎及脫水為主要癥狀，其死亡率較高[8,9]。國內外研究表明，鏈球菌有較強的耐藥性，且已經普遍存在并呈現逐年增高的趨勢，鏈球菌的耐藥性給臨床治療該病帶來一定困難，且其耐藥性可以在動物和人之間相互傳播，已成為公共衛生安全問題[10,11]。本試驗對采集患病仔豬病料樣品進行鏈球菌分離鑒定，并檢測其致病性和耐藥性，以期為山東莒南地區仔豬源鏈球菌的合理用藥提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 菌株來源

2020-2021年采集山東莒南縣部分養豬場病死仔豬的鼻拭子、肺臟和肝臟等組織病料127 份，采集的病料組織經處理后，進行鏈球菌的分離鑒定。

1.2 細菌分離與培養

將采集的樣品進行處理后，無菌條件下接種于7%綿羊脫纖血培養基上，進行增菌培養，37℃恒溫培養12～18 h 后，挑取單個菌落接種于鏈球菌培養基中進行鑒別培養（12～18 h），然后進行革蘭氏染色鏡檢觀察其形態學。

1.3 生化試驗鑒定

參照Raid ID 32 STREP 陽性菌鑒定試劑盒說明書進行試驗，將分離菌株接種在營養肉湯中培養至對數期，調整菌液濃度為0.5 個麥氏濁度，無菌條件下，接種于試紙條中，37℃培養12～18 h，然后進行生化特性鑒定。

1.4 細菌PCR 鑒定

設計細菌16S rRNA 基因通用引物，送上海生工生物工程技術服務有限公司合成引物（表1）。用水煮法提取分離菌株的基因組并進行PCR 鑒定。回收PCR 產物，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，通過BLAST 搜索比對結果，以確定為鏈球菌菌株。

表1 引物序列

表2 藥敏試驗結果

1.5 致病性試驗

將分離菌株接種于營養肉湯中，并培養至對數期，調整菌液濃度為107CFU/mL，每株分離菌株腹腔注射給2 只昆明系小鼠，劑量為0.25 mL/ 只（107CFU/mL），對照組小鼠腹腔注射等量的無菌生理鹽水。試驗期7 d，觀察小鼠的發病情況。

1.6 藥敏試驗

分離菌株的藥敏試驗參照美國國家臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）2013年推薦的藥敏試驗法標準進行操作與結果判定。

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養

疑似鏈球菌的菌株通過7%綿羊脫纖血培養基、甘露醇氯化鈉鑒別培養基分離培養及鏡檢觀察其形態學結果，均符合鏈球菌的培養特性和形態學特征。

2.2 細菌生化試驗

通過Raid ID 32 STREP 陽性菌鑒定試劑盒進行生化鑒定，68 株分離菌株初步鑒定為鏈球菌。

2.3 細菌PCR 鑒定

對初步鑒定為鏈球菌的菌落，用PCR 進行鑒定。結果顯示分離的68 株分離菌株均擴增出大約為1 500 bp的目的條帶（圖1）。通過測序對比68 株分離菌株與參考株（鏈球菌）的同源性均大于98%，構建系統發育樹（圖2）說明分離株為鏈球菌，此試驗鏈球菌的檢出率為53.5%（68/127）。

圖1 部分分離菌株PCR 鑒定結果

圖2 分離菌株代表株（JM202010）系統發育樹

2.4 致病性試驗

攻毒組小鼠在攻毒2～3 d 后，出現了不同程度的發病，且個別攻毒小鼠不表現任何癥狀而出現急性死亡，剖檢死亡小鼠后采集病料組織，分離得到鏈球菌，攻毒試驗結束后，對照組小鼠仍健康存活。經統計，有50株鏈球菌能引起小鼠死亡，確定為致病性菌株。

2.5 藥敏試驗

分離菌株的耐藥性分析顯示，50 株致病性鏈球菌對新霉素、氟苯尼考、大觀霉素、氨芐西林、慶大霉素、磺胺間甲氧嘧啶、青霉素、阿莫西林、氨芐西林、多西環素等9 種藥物的耐藥率為52.0%～84.0%，對頭孢噻呋、頭孢噻肟、恩諾沙星、環丙沙星、林可霉素5 種藥物耐藥率為4.0%～30%；說明臨床中分離的50 株致病性鏈球菌對臨床中常用的藥物具有不同的耐藥性。

3 討論

鏈球菌是一種臨床上常見的人畜共患的條件性致病菌，該菌廣泛存在于動物和人類的體內及環境中，可以通過多種途徑（直接接觸傳播、空氣傳播、創傷皮膚和黏膜、臍帶等感染）在不同動物（雞、豬）之間傳播[10,11]。鏈球菌可以引起豬、牛、羊、雞、鴨、兔等多種動物感染，急性病例具有發病比較急、死亡較迅速等特征，為臨床中畜禽常見的急性、敗血性疾病[12]。陳申申等[13]報道了從患有腦膜炎的仔豬體內分離得到致病較強的鏈球菌。王飛鴻等[14]從規模化養殖場死亡的仔豬中分離得到致病性較強的鏈球菌。豬鏈球菌病成為養豬業中常見的細菌性疾病之一，尤其對仔豬的危害較大。本試驗采集山東莒南地區養豬場病死仔豬的鼻拭子、肺臟和肝臟等病料組織127 份，分離到50 株致病性鏈球菌，說明鏈球菌在該地區豬場中流行較嚴重，可能對仔豬存在潛在威脅，養豬場應注意豬鏈球菌的防控，同時注意環境衛生，加強飼養管理，提高仔豬的免疫力。

臨床中豬鏈球菌病主要通過抗生素藥物進行防治，隨著抗生素的不合理使用或過量添加，豬場中的一些細菌對青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類等藥物產生了較強的耐藥性，其耐藥性菌株不斷出現，同一地區不同養殖場的細菌，其耐藥性也存在差異，降低了抗生素對豬病的治療效果[7]。本研究表明，50 株致病鏈球菌對新霉素、氟苯尼考、大觀霉素等9 種藥物耐藥率在52.0%以上，對其他的藥物耐藥率為4.0%～30%。說明從該地區養豬場中分離的鏈球菌對臨床中常用的藥物存在不同耐藥性，且耐藥嚴重。因此，在臨床中治療豬鏈球菌病應該進行藥敏試驗，選擇敏感的藥物進行交替使用，同時應該配合環境消毒，提高治療效果。

4 小結

綜上所述，豬鏈球菌在養豬場中普遍存在，從山東省莒南縣養豬場中采集的豬病料中，分離出50 株致病性鏈球菌，且其對新霉素、氟苯尼考、大觀霉素等9 種藥物的耐藥性較高。因此，養豬企業應重視豬場中的細菌性疾病，尤其人畜共患的鏈球菌病，在防治方面應做好環境衛生和合理使用抗生素藥物。