葡萄糖-PEG2000-DSPE 修飾卡馬西平納米系統對癲癇大鼠海馬線粒體內氧化應激作用

趙斐，謝旭芳，吳成斯，梁慧婷

南昌大學第一附屬醫院，江西 南昌 330006

癲癇是由于腦的興奮性和抑制性之間的不平衡而引起的反復發作的慢性神經系統疾病［1］。目前癲癇的治療主要通過抗癲癇藥物控制其發作，僅有60%的癲癇患者能有效緩解癥狀，且部分患者可能罹患認知、情緒障礙等合并癥［2］。因此，確定引起癲癇的原因和機制，尋找新的、針對性強的靶向藥物十分必要。卡馬西平是目前治療癲癇等神經系統疾病的主要藥物，若能夠有效地將卡馬西平輸送至大腦對于治療癲癇非常重要［3］。研究［4］表明，當藥物與葡萄糖（glucose，GLU）的6 碳結合時，嵌于細胞膜上的GLU 轉運體GLUT1 識別能力最強，說明GLU 修飾的藥物分子具有良好的靶向性。因此，本研究以海馬神經元細胞膜上的GLUT1 為靶標，并基于海馬神經細胞中線粒體內氧化應激機制，探究GLU-甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（GLU-PEG2000-DSPE）修飾卡馬西平納米系統腦靶向效果，對于臨床開發研究新型靶向治療癲癇藥物具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雄性斯波累格·多雷（Sprague Dawley，SD）大鼠60 只，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，生產許可證號：生產許可SCXK（滬）2022-0004，體重240 g 左右，所有SD 大鼠均置于SPF 級實驗動物房中飼養，環境溫度為22 ℃左右，均自由攝食及飲水。所有動物實驗均已經過南昌大學第一附屬醫院醫學倫理委員會的批準。

1.2 藥物與儀器

GLU-PEG2000-DSPE（上海炎怡生物科技有限公司），卡馬西平原料藥（常州亞邦制藥有限公司，國藥準字H20053419），超速冷凍離心機（美國貝克曼公司），透射電子顯微鏡（JEOL JEM-1220，Japan），酶標儀（BioTeK CytationTM5，UK），勻漿器（IKA T10B，Germany），高效液相色譜（HPLC）系統（美國Agilent 公司），超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 GLU-PEG2000-DSPE 修飾卡馬西平納米系統制備

薄膜分散法制備GLU-PEG2000-DSPE 修飾卡馬西平脂質體，將蛋黃卵磷脂、膽固醇、GLU-PEG2000-DSPE、卡馬西平按照摩爾比為95∶20∶5∶6.35（質量比為3.907∶1.02∶1∶0.5）用氯仿溶解于圓底燒瓶中。減壓條件下蒸發該混合物形成薄的脂質膜，生理鹽水超聲水化形成脂質體溶液，并通過100 nm聚碳酸酯膜擠出，過G50 葡聚糖凝膠柱除去未包裹卡馬西平，于4 ℃備用。

1.4 電鏡觀察納米粒子的表征

使用透射電子顯微鏡觀察納米粒子的表面形態。取制備好的脂質體溶液用超純水稀釋10 倍，取1 滴滴加在230 目銅網上，再滴加0.5%磷鎢酸溶液，晾干后使用透射顯微鏡觀察并拍攝。負載熒光染料DiR 的納米粒子的制備方法同上。

1.5 細胞培養

隨機選取10 只SD 大鼠取其完整的海馬組織，經PBS 漂洗后將海馬組織剪成小塊，并放入培養液中。將小塊海馬組織離心后去除上清液，加入20%FBS 懸浮中和，再次離心，去除神經和血管組織，收集沉淀（底部沉淀為大鼠海馬神經元細胞）。

1.6 細胞毒性實驗

取96 孔板，每孔鋪大鼠神經元細胞5 000 個，過夜，隨機均分為兩組，將制備好的納米粒子和單純的卡馬西平按15、30、45、80、100、200、400 μg/mL濃度梯度分別給藥每孔細胞中，孵育48 h后，加10 μM 濃度為5 mg/mL 的MTT 溶液。培養箱繼續培養4 h 后，棄去培養液，每孔加入100 μL DMSO 溶液，酶標儀振板10 min，490 nm 檢測OD 值，計算各濃度下各制劑的48 h 細胞存活率。

1.7 分組與造模

將剩余50 只SD 大鼠隨機分為四組，一組為正常組（n=10），其余三組進行造模，分別為模型組（n=10）、卡馬西平組（n=15）、納米組（n=15）。所有SD 大鼠按照分組分籠飼養于SPF 級動物房，適應性飼養1 周后進行實驗。根據氯化鋰-匹羅卡品誘導法構建癲癇大鼠模型，觀察大鼠的行為學變化并根據Racine 評級標準判斷癲癇模型是否制備成功，若大鼠出現Ⅳ級以上的持續癲癇狀態，表明模型制備成功。本研究癲癇模型40只大鼠均構建成功。

1.8 檢測癲癇大鼠腦組織中卡馬西平含量

隨機從卡馬西平組、納米組各選取5 只大鼠，分別給卡馬西平組大鼠注射單純的卡馬西平溶液，納米組注射GLU-PEG2000-DSPE 修飾的卡馬西平納米粒子溶液，各組溶液濃度根據細胞毒性實驗結果注射。藥物干預2 h 處死兩組大鼠，收集其腦組織，沖洗后稱重，并制備10%的勻漿液。勻漿液與1 mL乙酸乙酯充分混合、離心后，取上層有機相，重復3 次萃取過程，然后用濾頭過濾，用200 μL 流動相復溶殘余物，最后取20 μL 用HPLC 系統分析。

1.9 檢測各組大鼠的海馬組織病理學變化及氧化應激相關指標

卡馬西平組、納米組各10 只大鼠，經藥物干預24 h 后處死各組大鼠，取部分海馬組織經HE 染色后，在顯微鏡下觀察并記錄其病理變化。另取部分海馬組織制備海馬組織勻漿，吸取上清液，按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書進行操作，通過化學比色法檢測大鼠海馬組織中氧化應激因子SOD、GSH-Px、MDA 的含量。

1.10 統計學方法

2 結果

2.1 納米粒子的表征及粒徑

不擔載卡馬西平藥物的聚合物納米粒子粒徑最低為40 nm，最高為60 nm，呈分散均勻的球形，而擔載抗癲癇藥物卡馬西平的聚合物納米粒子粒徑最低為70 nm，最高為90 nm，表面形態也為球形，無明顯改變，但粒徑明顯增加（P＜0.05）。見圖1。

圖1 電鏡觀察納米粒子的表征（×100）

2.2 不同濃度的卡馬西平納米粒子對神經元細胞的毒性

80 μg/mL 及以上單純的卡馬西平對神經元細胞產生明顯的毒性作用，而各濃度下卡馬西平納米粒子均對神經元細胞無明顯毒性作用。在80 μg/mL 及以上時，卡馬西平納米粒子溶液中神經元細胞存活率明顯高于單純的卡馬西平。在100 μg/mL 時，卡馬西平納米粒子對細胞的毒性最低，與單純的卡馬西平相比具有明顯差異。見圖2。

圖2 不同濃度的卡馬西平納米粒子對神經元細胞的毒性

2.3 卡馬西平在癲癇大鼠腦部藥物定量分析

根據細胞毒性實驗，卡馬西平組、納米組大鼠注射的卡馬西平濃度均為15 μg/mL。通過藥物定量分析顯示，納米組大鼠海馬組織中卡馬西平含量（1.69±0.17）μg/mL 明顯高于卡馬西平組（1.02±0.10）μg/mL（P＜0.05）。見圖3。

圖3 癲癇大鼠腦組織中卡馬西平含量

2.4 各組大鼠海馬組織神經元病理形態結果

根據細胞毒性實驗，在100 μg/mL 時，卡馬西平納米粒子對細胞毒性最低，在15 μg/mL 時，單純的卡馬西平對細胞毒性最低，基于此，檢測卡馬西平對癲癇大鼠海馬組織神經元病理形態的影響。正常組大鼠腦皮質、顆粒細胞等結構輪廓完整，核仁清晰，染色質均勻；模型組大鼠海馬組織神經元細胞排列紊亂，細胞發生膨脹、破裂，細胞間距加大；卡馬西平組大鼠海馬組織神經元排列稍有改善，細胞水腫明顯；納米組大鼠海馬組織神經元細胞排列較為整齊，細胞無明顯水腫，細胞間距變小，見圖4。

圖4 卡馬西平對癲癇大鼠海馬組織病理改變的影響（HE染色，×400）

2.5 各組大鼠海馬組織中氧化應激相關指標水平

與正常組相比，模型組大鼠海馬組織中SOD、GSH-Px 含量明顯下降，MDA 含量明顯上升（P＜0.05）。與模型組相比，卡馬西平組、納米組大鼠海馬組織中SOD、GSH-Px 含量明顯上升，MDA 含量明顯下降（P＜0.05）。與卡馬西平組相比，納米組大鼠海馬組織中SOD、GSH-Px 含量明顯上升，MDA 含量明顯下降（P＜0.05）。見圖5。

圖5 大鼠海馬組織中氧化應激相關指標

3 討論

癲癇發作時腦組織產生大量活性氧，對線粒體產生毒性作用，導致線粒體結構受損、能量代謝功能障礙［5］。正常情況下腦細胞主要依靠GLU 的有氧氧化獲得能量，而腦部攝取GLU 主要通過葡萄糖轉運體家族（GLUTs）轉運來實現［6］。研究顯示，將抗腫瘤藥物與葡萄糖連接起來形成綴合物可實現靶向輸送藥物、提高抗腫瘤效果，其作用機制與細胞通過GLUT 1 受體攝取GLU 綴合物有關［7］。納米粒子的大小在粒子的生物分布、消除和傳遞中起著重要作用。本研究結果顯示，擔載卡馬西平的聚合物納米粒子表面形態呈分散均勻的球形，粒徑明顯大于不擔載卡馬西平藥物的聚合物納米粒子。

細胞毒性實驗顯示，卡馬西平納米粒子在各濃度下均對細胞無明顯毒性作用，在80 μg/mL 及以上時，其細胞存活率明顯高于單純的卡馬西平。表明GLU-PEG2000-DSPE 對正常細胞的存活率無明顯影響，并且在擔載卡馬西平后，卡馬西平對細胞的毒性作用可以顯著減輕。研究表明，PEG2000-DSPE 修飾鹽酸表阿霉素脂質體后顯著降低藥物毒性［8］，與本研究結果一致。卡馬西平穿過血腦屏障能力較低，而納米粒子藥物蓄積和遞送能力更強，將有利于藥物的定向傳送和藥效的發揮。本研究結果顯示，納米組大鼠海馬組織中CBZ 含量明顯高于卡馬西平組。有研究［9］顯示，通過RVG29-PEG-PLGA 納米粒子可以更多地積累在腦組織中，可以有效保護缺血性腦卒中大鼠的神經功能。本研究探索卡馬西平納米粒子對癲癇大鼠的治療作用，結果顯示，卡馬西平組、納米組大鼠海馬組織病理形態相較于模型組均有所改善，且納米組大鼠改善效果更佳。表明GLU-PEG2000-DSPE 修飾卡馬西平納米系統能有效改善癲癇大鼠的病理狀態。

研究［10］表明，氧化應激是癲癇發病的重要病理機制。大腦幾乎是單一通過線粒體呼吸鏈的有氧代謝獲取能量，且抗氧化能力弱，非常容易受氧化應激損傷，目前機體對抗氧自由基主要依賴自身的抗氧化酶系統，其中SOD 和GSH-Px 是機體主要的抗氧化酶［11-12］。MDA 是細胞脂質過氧化的直接產物，其含量可反映機體氧化應激損傷程度［13］。本研究結果顯示，與模型組和卡馬西平組相比，納米組大鼠海馬組織中SOD、GSH-Px 含量明顯上升，MDA 含量明顯下降。表明GLU-PEG2000-DSPE 修飾卡馬西平納米粒子可以有效緩解癲癇大鼠海馬組織中的氧化應激作用。

綜上所述，GLU-PEG2000-DSPE 修飾卡馬西平納米粒子可以有效改善癲癇大鼠海馬組織的病理狀態，緩解其氧化應激損傷。