GC-MS/MS 法檢測腸炎寧片及其藥材中禁用農藥殘留

余德發，孫新琪，于肖輝,3，何春嬌，郭夢月，駱驕陽，楊美華

1.江西康恩貝中藥有限公司，江西 上饒 334400；2.中國醫學科學院，北京協和醫學院，藥用植物研究所，中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，北京 100193；3.江西康恩貝天施康藥業有限公司，江西 鷹潭 335000

腸炎寧片是常見的胃腸道用藥，該制劑中包含的中藥分別為：金毛耳草、地錦草、楓樹葉、香薷和樟樹根。金毛耳草性涼味苦，能夠清熱，收斂止瀉；地錦草、楓樹葉的功效為清熱、解毒，能夠最大限度地使金毛耳草發揮其藥效；而香薷、樟樹根則是一種輔助性的藥材，具有祛風、止痛、祛濕的特性［1］。腸炎寧片是一種多功能的復合物，能夠消除炎癥，改善腸道功能。它可以治療腸炎，包括急性胃腸炎、慢性胃腸炎、消化不良等［2］。腸炎寧片在臨床上應用廣泛，使其在種植、運輸與加工生產過程中，對其原料藥的質量和安全控制顯得更加重要。近年來，為了有效地控制和預防疾病和害蟲，中藥材種植過程中常常使用農藥［3］。《中國藥典》2020 年版通則0212［4］對33 種禁用農藥作出了嚴格的限制，其含量必須低于定量限。禁用農藥的殘留可能導致人和動物嚴重的健康問題，主要損害心腦血管、肝腎等部位，甚至會致畸、致癌、致突變［5］。因此，建立對腸炎寧片及其主要原料藥的禁用農藥殘留檢測方法是十分必要的。

本研究選取《中國藥典》2020 年版四部［4］中2341 第四法農藥多殘留量測定法項下氣相色譜質譜聯用法（GC-MS/MS）中的31 個農藥化合物（20種禁用農藥）在腸炎寧片及其主要原料藥材金毛耳草和地錦草中進行檢測。金毛耳草的主要成分是雞矢藤苷甲酯、蘆丁、烏索酸等［6］，地錦草主要成分為黃酮類化合物（槲角素、山柰素等）和有機酸類（沒食子酸等）［7］。這兩種藥材都是復雜基質，干擾較大，增加了檢測農藥殘留的難度。Quick（快速）-Easy（容易）-Cheap（便宜）-Effective（有效）-Rugged（穩定）and Safe（可靠）（QuEChERS）法是一種基于固相萃取的技術，能夠有效防止由于液-液分配所帶來的乳化問題，并且具備節省有機溶劑的使用以及縮短前處理用時的特點［8］。QuEChERS 法由萃取和凈化2 個階段組成。在萃取階段，使用無水硫酸鎂協助提取，使用氯化鈉或無水乙酸鈉來提取“對堿敏感的化合物”［5］。凈化階段，去除藥材中有機酸和極性色素效果較好的為N-丙基乙二胺（PSA）［9］；亦可搭配十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）一起使用，目的為除去多余的脂類和甾醇［10］，或使用石墨化炭黑（GCB）來降低色素等干擾物的存在［11］。由于金毛耳草、地錦草基質復雜，干擾較大，本研究采用改良后QuEChERS 法對腸炎寧片、金毛耳草、地錦草中31 個禁用農藥進行了GC-MS/MS檢測，為企業和相關部門對于此類方法的開發和應用提供參考。

1 實驗材料

7890B-7010 氣相色譜-三重四級桿串聯質譜儀(美國Agilent 公司)；NV-15G 氮吹儀(美國Agela 公司)；電子天平(瑞士Mettler-Toledo 公司)；Eppendorf 移液槍(德國Eppendorf 公司)；SF-TGL-20A 高速離心機(中國上海菲恰爾分析儀器有限公司)。乙腈（色譜純）由美國Fisher Scientific 公司供應。31 種禁用農藥混合標準品（100 μg/mL）由天津阿爾塔科技有限公司提供。無水硫酸鎂（MgSO4）、無水乙酸鈉（CH3COONa）、冰醋酸、N-丙基乙二胺吸附劑（PSA）、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）、石墨化碳黑（GCB）和硅膠由中國天津艾杰爾公司提供。純凈水由杭州娃哈哈集團有限公司提供。微孔濾膜（0.22 μm）購買于上海安譜實驗科技股份有限公司。腸炎寧片（江西康恩貝中藥有限公司，國藥準字Z36020518，規格：420 mg）5 批。3 批金毛耳草產自江西省撫州市南豐縣（批號分別為YZ002-190908、YZ002-200902、YZ002-200908）。2 批地錦草產自湖南省衡陽市（批號分別為YZ001-181208、YZ001-190403）。

2 方法

2.1 色譜條件

采用DB-5MS 柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）進行分離分析。進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，溶劑延遲時間4 min。使用高純氦氣（He）為載氣。進樣口模式為恒壓，柱前壓力為146 kPa。程序升溫：保持初始溫度60 ℃ 1min，以30 ℃/min 的速度升至120 ℃，以10 ℃/min 的速度升溫至160 ℃，再以20℃/min 的速度升溫至230 ℃，最后以15 ℃/min 的速度升溫至300 ℃，并維持6 min。

2.2 質譜條件

采用三重四極桿串聯質譜儀；離子源為電子轟擊源（EI），離子源溫度為230 ℃，電壓為70 eV。碰撞氣為氮氣，質譜傳輸接口溫度250 ℃。質譜監測模式為多反應監測（MRM），根據《中國藥典》2020 年版的規定來設置監測離子對和碰撞電壓（CE）。

2.3 農藥混合標準品溶液的制備

所購買的31 種農藥混合標準品貯備液濃度為100.0 μg/mL。取10 μL 用乙腈將其稀釋至10 mL，混合均勻，即得中間標準品溶液（100 ng/mL），通過中間標準品溶液制備濃度為50 ng/mL 的工作溶液，并在-20 ℃的環境下進行保存。

2.4 供試品溶液的制備

將過三號篩的1.0 g 藥材樣品粉末放入50 mL聚苯乙烯具塞離心管內。加入1%冰醋酸10.0 mL，充分渦旋，使藥材粉末完全浸潤于溶液中，在室溫環境中靜置30 min。加入20.0 mL 乙腈，渦旋混合均勻，在振蕩器上振蕩5 min。加入7.5 g 按照4∶1的比例配制的無水MgSO4與無水CH3COONa 混合物，立即搖散，將其放于振蕩器上振蕩5 min，以8 000 r/min 的速度離心處理5 min。將9 mL 上清液加入凈化劑（無水MgSO4：900 mg、PSA：300 mg、C18：300 mg、硅膠：300 mg、GCB：100 mg）中，充分渦旋，使之完全混合，放置于振蕩器上，振蕩5 min，再以8 000 r/min 的速度離心處理5 min。取5 mL 上清液放入10 mL 離心管內，置于NV-15G 氮吹儀上，在40 ℃水浴的條件下將其濃縮至約0.5 mL，并用乙腈定容至1 mL，渦旋混勻，使得溶劑通過微孔濾膜（0.22 μm），即得。

3 結果與討論

3.1 色譜條件與質譜條件優化

根據《中國藥典》2020 年版四部［4］中2341 農藥殘留檢測法項下的信息，選用與藥典極性相同的色譜柱。化合物的出峰時間和峰形會受到具體色譜柱型號和儀器狀態的影響，因此需要對質譜參數進行優化和確定，詳見表1。31 個禁用農藥在乙腈溶劑中的總色譜流圖如圖1 所示。

圖1 31個禁用農藥的GC-MS/MS總離子流圖（50 ng/mL）

3.2 前處理方法考察

QuEChERS 法是本研究采用的前處理方法。在農藥分析中，選擇使用的溶劑應盡可能提取出所測定的全部目標分析物，而不提取出或少量提取出樣品基質中的其他成分及干擾物。QuEChERS 技術可以使用多種不同的提取溶劑，如乙腈、乙酸乙酯、甲醇和丙酮等。其中，乙腈能有效地提取具有較大極性范圍的農藥，而且在處理過程中，可以有效地減少雜質的提取［12］。本研究根據31 個禁用農藥的溶解性和穩定性，選擇的提取溶劑為乙腈，對比了分別加入10 mL 和20 mL 乙腈提取溶液顏色的變化（圖2）。結果表明，加入20 mL 乙腈提取制備的溶液澄清無渾濁，符合上機要求；而加入10 mL 乙腈提取制備的溶液色素殘留嚴重，上機檢測可能會增加色譜柱污染的概率。因此，選擇20 mL 乙腈進行提取。

圖2 優化前、優化后凈化處理效果對比圖：A.金毛耳草；B.地錦草；C.腸炎寧片

中草藥提取物中常含有大量色素、天然樹脂、大分子脂質、蛋白質等其他物質。這些物質可能在GC-MS/MS 分析過程中污染進樣口和色譜柱，從而影響色譜分離，使色譜柱壽命縮短［13］。為了解決該問題，本研究加入了一些去除這些基質化合物的凈化劑。C18 可有效去除油性基質化合物［14］。PSA 可以去除有機酸、脂肪酸、糖和其他可形成氫鍵的成分［9］。GCB 具有很強的去除色素的能力，如葉綠素和類胡蘿卜素［15］。根據腸炎寧片、金毛耳草和地錦草藥材可能存在的成分，本研究采用的凈化劑為300 mg PSA、300 mg C18、100 mg GCB、300 mg 硅膠和900 mg 無水MgSO4。相比藥典中的QuEChERS方法增加了10 mg GCB，以達到更好的凈化效果。

3.3 方法學考察

《中國藥典》2020 年版四部2341 項下，規定了GC-MS/MS 檢測禁用農藥時所使用的計算方法是內標定量法。本研究選擇磷酸三苯酯為內標，分別配制質量濃度為1、2、5、10、25、50、100 ng/mL 的31個農藥混合標準工作液，在優化條件下測定。標準曲線的橫坐標為目標化合物濃度/內標化合物濃度，縱坐標為目標化合物峰面積/內標化合物峰面積。雖然采用內標法引入了加入內標可能存在的誤差，但這些誤差相比于批間差異所造成的誤差而言是較小的。定量限可依據信噪比來判斷，定量限（LOQ）為信噪比大于等于10 時的農藥濃度，檢出限（LOD）為信噪比大于等于3 時的農藥濃度，表2 為線性、LOD、LOQ 等結果。結果表明，31 個農藥的線性范圍為1～100 ng/mL，LOD 為0.3～7.0 μg/kg，LOQ 為1.0～25.0 μg/kg。回收實驗按照向空白藥材基質中加標50 μg/kg 的濃度進行，6 次平行測定。通過測定量與添加量的比較，對每一種農藥的回收率進行計算。回收率為72.0%～113.0%，相對標準偏差（RSD）值在2.4%～17.8%之間（圖3），回收率合格，精密度、重復性良好，均符合《中國藥典》對禁用農藥檢測的要求。

表2 31個禁用農藥在腸炎寧片、金毛耳草和地錦草中的LOD、LOQ和線性關系

圖3 31個禁用農藥的回收率

3.4 樣品及藥材檢測結果

針對腸炎寧片及其原藥材進行檢測，共檢測腸炎寧片5 批、金毛耳草3 批、地錦草2 批，結果31 個禁用農藥均未檢出，符合藥典標準。通過原藥材產地調查得知，金毛耳草、地錦草多為野生藥材，僅有少量栽培。栽培過程中嚴格把控質量要求，避免禁用農藥等有毒、高殘留農藥的噴施，保障藥材和成藥腸炎寧片的安全性。

4 結論

本研究采用GC-MS/MS 結合改良后QuEChERS法建立了31 個禁用農藥的檢測方法，對腸炎寧片及其原藥材金毛耳草和地錦草進行檢測，方法學考察均合格，滿足農藥殘留分析的要求，可用于腸炎寧片的安全性監測。